Heterologous production of flavanones using synthetic genes in Streptomyces venezuelae

Abstract

Flavonoids are plant secondary metabolites with potential pharmacological and nutraceutical properties. In this study, flavonoid biosynthetic genes were heterologously expressed in an engineered strain of Streptomyces venezuelae DHS2001 bearing a deletion of pikromycin polyketide synthase gene. A plasmid expressing the 4-coumarate/cinnamate:coenzyme A ligase from Streptomyces coelicolor (ScCCL) and the chalcone synthase from Arabidopsis thaliana (atCHS) under the control of a single ermE* promoter was constructed and introduced into S. venezuelae DHS2001. The resulting strain produced racemic naringenin (0.2 mg/l) and pinocembrin (0.4 mg/l) from 1.2mM 4-coumaric acid and cinnamic acid, respectively. Placement of an additional ermE* promoter upstream of the codon-optimized atCHS (atCHS_(op)) gene increased the yield of naringenin and pinocembrin by 18-fold and 15-fold, respectively. To synthesize (2S)-flavanones, a codon-optimized chalcone isomerase genes from Pueraria lobata, Arabidopsis thaliana, and Medicago sativa were co-expressed with the ScCCL and atCHSop genes. These results demonstrate the possibility of engineering S. venezuelae as an alternative heterologous host for the production of valuable plant-specific polyketide compounds.;플라보노이드 (flavonoid)는 식물 유래의 대표적인 이차대사산물로서, 항산화, 암예방, 항천식, 항염증 등의 활성을 갖는 건강 증진용 기능성 식품이다. 본 논문은 이종숙주의 코돈 선호도 (codon preference)를 고려한 합성 유전자를 이용하여 방선균 내에서 식물 특이적 플라보노이드 계열 화합물의 생산과 대사공학을 이용한 생산성 향상을 시도하였다. 일차적으로, 플라보노이드 생합성 유전자를 피크로마이신 폴리케타이드 (pikromycin polyketide) 생합성 유전자가 제거된 Streptomyces venezuelae DHS2001에서 발현하여 이종숙주에서 플라바논의 생산을 확인하였다. Streptomyces coelicolor 유래의 4-coumarate:coenzyme A ligase (ScCCL)과 Arabidopsis thaliana 유래의 chalcone synthase (atCHS)를 확보하여 ermE* 프로모터를 가지는 플라스미드에 클로닝하고 S. venezuelae에서 발현시킨 결과, 첨가해 준 4-coumaric acid와 cinnamic acid로부터 0.2 mg/l의 나린제닌 (naringenin)과 0.4 mg/l의 피노셈브린 (pinocembrin)이 라세믹 형태로 각각 생산되었다. 다음으로 이종숙주에서 생산량을 향상시키기 위하여 각각의 유전자 앞에 ermE* 프로모터를 위치시키고, S. venezuelae가 선호하는 코돈을 사용한 atCHS 유전자를 발현시킨 결과 나린제닌과 피노셈브린의 생산성이 각각 18배, 15배 증가하였다. 플라본 또는 플라보놀과 같은 다양한 종류의 유용한 플라보노이드 화합물의 생합성에 관여하는 효소들은 (2S)-플라바논을 매개로 하며, 라세믹 형태의 플라바논을 (2S)-플라바논으로 전환시키기 위해서는 chalcone isomerase가 필요하다. 이에 Pueraria lobata, Arabidopsis thaliana와 Medicago satava유래의 chalcone isomerase 유전자를 codon 최적화하여 합성하고, ScCCL-atCHS_(op)유전자와 함께 발현한 결과, 최종적으로 S. venezuelae에서 (2S)-flavanones을 생산하였다. 이상의 연구를 통해, 식물 특이적인 폴리케타이드 화합물을 생산하기 위한 이종숙주로써S. venezuelae의 가능성을 보여주었다.