고전적 돌연변이 및 대사공학적 접근 방법을 이용한 라파마이신 생산성 향상

Abstract

Rapamycin is a macrocyclic polyketide with immunosuppressive, antifungal, and anticancer activity. The production level of rapamycin in Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253 was enhanced by combination of classical mutagenesis and metabolic engineering approach. Rapamycin production by a mutant strain (UV2-2) induced by Ultraviolet (UV) mutagenesis was improved by approximately 3.2-fold (23.6 mg/l) compared to that of wild-type strain. The comparative analyses of gene expression and intracellular acyl-CoA pool between wild-type and the UV2-2 strains revealed that the increased production of rapamycin in UV2-2 was due to the prolonged expression of rapamycin biosynthetic genes but the low intracellular concentration of methylmalonyl-CoA was limiting the rapamycin biosynthesis in both strains. In an attempt to promote intracellular pool of methylmalonyl-CoA, propionyl-CoA carboxylase pathway was introduced into the mutant strain UV2-2 along with supplementation of methyloleate, resulting in an additional 1.7-fold improvement of rapamycin titers (40.1 mg/l). These results demonstrate that the combined approach involving traditional mutagenesis and metabolic engineering can be successfully applied for the development of a high-producing strain of the target polyketide as well as show the possibility that further metabolic engineering of classically improved industrial strains would facilitate the additional improvement in production of the desired metabolites.;본 연구는 Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253의 이차대사산물인 면역억제제 라파마이신 (rapamycin)의 고생산 균주를 제작하기 위하여, 무작위적인 돌연변이 및 propionyl-CoA carboxylase의 인위적인 과발현을 통한 라파마이신의 생산성 향상에 관한 연구 결과이다. propionyl-CoA carboxylase의 인위적인 과발현은 라파마이신의 생합성 전구체인 methylmalonyl-CoA의 세포내 농도를 높이기 위한 것이다. 본 연구에서는 자외선 (UV)에 의한 무작위적인 돌연변이를 통하여 7.3 ㎎/ℓ의 라파마이신을 생산하는 자연생산균주보다 3.2배 향상된 23.6 ㎎/ℓ의 라파마이신을 생산하는 UV2-2 돌연변이 균주를 선별하였다. 라파마이신 생산성 향상의 원인을 규명하기 위하여 자연생산균주와 선별된 돌연변이로 UV2 및 UV2-2의 DNA 전사 수준과 세포내 acyl-CoA양을 분석하였다. 분석결과 UV2-2 돌연변이 균주에서 라파마이신의 생산성이 향상된 원인은 라파마이신 생합성 유전자의 지속적인 발현에 의한 것으로 확인되었다. 그러나 세포내 methylmalonyl-CoA의 양은 두 균주 모두에서 매우 적은 양이 검출되어 methylmalonyl-CoA의 세포내 농도가 라파마이신 생합성의 제한 요인으로 작용하는 것으로 예측되었다. 따라서 세포내 methylmalonyl-CoA 향상을 위해 UV2-2 돌연변이 균주에 propionyl-CoA carboxylase (PCC) 생합성 경로를 인위적으로 과발현 시키고 methyloleate를 첨가하여 23.1 ㎎/ℓ의 라파마이신을 생산하는 UV2-2 돌연변이 균주보다 1.7배 향상된 40.1 ㎎/ℓ의 라파마이신을 생산하였다. 이처럼 무작위적인 돌연변이 방법과 대사공학적 접근 방법을 통하여 폴리케타이드 계열화합물의 고생산 균주를 성공적으로 제작할 수 있었다. 그리고 이를 통하여 전통적 돌연변이 방법을 이용하여 선별된 고생산 산업균주에 특정 전구체를 과발현시키는 대사공학적 접근방법을 통하여 추가적인 생산성 향상의 가능성을 제시할 수 있었다.