Fabrication of Polymer-Based Microfluidic and Nanofluidic Devices and Their Bioapplications

Abstract

마이크로, 나노 유체 소자는 적은 양의 시료로 정확한 실험 수행을 가능하게 한다는 점에서 기존의 생물학적 실험에 많은 이점을 제공한다. 또한, 동일 유행의 실험을 동시 진행할 수 있는 소형화된 플랫폼을 제공함으로서 단시간 내에 통계적으로 의미 있는 데이터를 도출 해 낼 수 있게 해준다. 그러나 현재까지 개발된 대부분의 미세 유체 소자는 실제 생물학자들이 사용하기에 용이하지 못한 문제점을 가지고 있다. 따라서 이 논문을 통해 기존의 유체 소자가 가지는 문제점을 개선하기 위해 제작 및 사용이 용이하도록 개발된 마이크로 나노 유체 플랫폼을 소개하고자 한다. 논문의 전반부에는 자외선에 의해 경화되는 고분자를 대안적 재료로 사용하여 생물학 시료에 적합한 친수성 마이크로 또는 나노 유체 채널을 간단하게 제조하는 방법을 소개한다. 나아가서는 이들 유체 소자를 면역 분석 플랫폼으로 응용한 예를 보여 준다. 논문의 후반부에는 특별히 진핵 세포 배양 시스템으로서의 미세 유체 시스템의 구축 및 사용에 관해 설명할 것이다. 이것으로 본 논문에 대한 전반적인 설명을 마치고 다음으로 각각의 장에 대한 간략한 소개를 덧붙인다. 제 I 장 에서는 자외선 경화성 폴리우레탄 계열 고분자인 Norland Optical Adhesive (NOA 63)를 대안적 재료로 이용하여 친수성 마이크로 유체 소자를 제조하는 간단한 방법을 소개한다. 전통적으로는, 마이크로 구조의 주조가 용이하고 값이 싼 polydimethylsiloxane (PDMS)가 유리나 SiO2의 대안으로 마이크로 유체 소자 제작에 널리 이용되어 왔다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고 PDMS는 극히 낮은 표면 장력 때문에 외부의 별도 펌프 시스템의 도움 없이는 마이크로 채널내로 유체가 유입되지 않는 다는 점에서 마이크로 채널로서 이용되기에 치명적인 문제점을 내포한다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 PDMS 표면을 친수성으로 변화시키기 위한 공정 개발에 노력이 집중 된 바 있으나, 유도된 친수성의 수명이 짧거나 다단계의 공정 과정을 요하는 단점이 있어왔다. 본 연구에서는 NOA를 이용하여 PDMS만큼 쉽게 마이크로 채널을 주조하고 칩을 제작하는 방법을 소개하며 산소 플라즈마 처리만으로 유도된 NOA 표면의 친수성이 적어도 한 달 이상 유지 되는 것을 보고하는 바이다. 또한 그 기간 동안 유지되는 채널의 친수성으로 인해별도의 펌프 없이 모세관 현상만으로 용액이 채널 내부로 자발적으로 유입되는 장점을 가지므로 항체 고정 비드를 이용한 간단한 면역분석 시스템을 구축하여 그 응용 가능성을 보이고자 한다. 제 II 장에서는 NOA를 이용하여 간단하면서 저가의 공정으로 친수성의 나노 유체 칩을 제작하는 기술을 소개한다. 공정은 간단하게 NOA로 제작된 나노 채널 구조 표면위에 PDMS 박막을 코팅하고, 이를 덮개 층인 유리 기판과 함께 산소 플라즈마 처리 후 붙이는 것으로 이루어진다. 이 공정은 나노 구조의 결함이 없는 정확한 나노 채널을 보장 할 뿐 아니라 표면의 친수성을 제공한다. 또한 이 친수성은 적어도 한 달 이상 유지 되는 특성을 가진다. 제 III 장에서는 마이크로, 나노 패턴을 이용하여 줄기 세포 연구를 수행하였다. 간엽 줄기 세포는 다양한 계통의 세포로 분화 가능한 세포이며 비교적 용이하게 얻을 수 있는 줄기 세포이다. 많은 연구들이 이 다분화성 세포를 재생 의학에 이용하기 위하여 그 목적에 맞도록 특정 계통의 전구 세포로 분화시키기 위한 효과적인 방법을 찾는데 노력을 기울이고 있다. 최근, 간엽 줄기세포가 붙어서 자라는 표면의 표면 형태가 세포의 운명에 영향을 미친다는 연구 결과가 있었다. 또한 세포가 접하는 매트릭스의 신축성 정도가 세포 계통 결정에 관여한다는 것도 보고된 바 있다. 본 연구는 신축성 정도가 다른 두 가지 고분자, 즉 약한 탄성 중합체인 PDMS와 단단한 에폭시 계열의 감광성 고분자인 SU8에 다양한 사이즈의 선 패턴의 기판을 제작하고 세포를 배양함으로서, 표면 형태와 매트릭스의 탄성 이 두 가지 요소가 세포의 모양과 액틴 세포 골격의 배열 및 구조에 동시적으로, 그리고 독립적으로 영향을 미친다는 것을 보여준다. 제 VI 장에서는, 마이크로 스케일에서의 포유류 세포 관련 연구 및 응용에 생물학적으로 적합한 모델인 미세 유체 삼차원 세포 배양 시스템을 소개한다. 마이크로 시스템에서 세포를 삼차원 상태로 지지하기 위해 다양한 천연 또는 합성 하이드로젤이 이용되어 왔다. 그러나 하이드로 젤 내에 세포를 포집하는 방법은 그 조작 과정이 복잡하며, 젤 내의 물질 이동이 원활하지 않고, 세포외 기질 구조는 느슨하고 세포가 밀집 된 구조를 가지는 조직을 모사하기에는 적합하지가 않다. 이 장에서는 젤을 사용하지 않으면서 마이크로 유체 소자 내에서 세포를 삼차원 배양 할 수 있는 시스템을 소개한다. 이 시스템은 세포 간 고분자 연결체와 마이크로 기둥 배열 구조를 이용하여 마이크로 채널 내에서 3차원 세포 집합체의 실시간 형성 및 고정을 유도한 것으로, 세포를 지지하기 위해 젤 내부에 포집하는 것이 불필요한 방법이다. 젤 배제 삼차원 마이크로 유체 세포 배양 시스템을 이용하여 포유류 세포주 (A549, C3A) 배양과 초대 배양 (mesenchymal stem cells)이 모두 성공적으로 배양되었다. 또한 이에서 배양된 세포들이 삼차원 세포 형태, 세포 기능 및 분화능을 보이므로, 이 시스템을 부착성 포유류 세포의 삼차원 세포 배양 플랫폼으로서 다목적 이용이 가능하리라 여겨진다.;Microfluidic and nanofluidic devices can offer many advantages over conventional biochemical assays by enabling researchers to accurately handle a small volume of sample solution. In addition to the accuracy, the miniaturized fluidic devices allow researchers to perform biological assays in parallel ways, thereby providing statistically meaningful data within a relatively short time. In general, however, the devices are still considered inconvenient and not user-friendly to biologists. This motivated me to develop useful microfluidic and nanofluidic bioplatform which can be easily fabricated and easy to be used by biologists. Thus, in this dissertation, I developed polymer-based micro- and nano-fluidic devices which suit to application in biology. First, I developed simple route of hydrophilic micro- and nano-channel fabrication and a bioplatform for immunoassay using them, which were described in Chapter I and II. Later on, I focused on developing simple systems for applications of fluidic devices in culturing eukaryotic cells. The details regarding these are described in Chapter III and IV. The synopsis of my thesis is ended here and I will describe each chapter as follow. In chapter I, I introduce a simple route to fabricating hydrophilic microfluidic chips with an alternative material, a UV-cured polyurethane-related polymer, known as Norland Optical Adhesive (NOA 63). Conventionally, polydimethylsiloxane (PDMS) is widely used to fabricate microfluidic chips as an alternative to glass or SiO2 because PDMS is easily molded and relatively cheap. However, despite these advantages, the hydrophobicity of PDMS entails critical problems when it is used in microfluidic chips because microchannels inside the microfluidic chips, which have extremely low surface tension, are difficult to fill with aqueous solution without an extra pumping system. To overcome these problems, significant efforts have been focused on developing procedures to change the PDMS surface to be hydrophilic. However, the resulting hydrophilicity is generally short lived and the modification procedures require cumbersome multi-steps. In the present study, I demonstrate that microchannel-molding and microfluidic chip construction are easier using NOA 63 than when using PDMS. Futhermore, the hydrophilicity of the NOA surface, which is induced by treatment with O2 plasma, lasts longer, for at least one month. Due to the longer lasting hydrophilicity, microchannels in NOA 63 microfluidic chips are spontaneously filled with solution by capillary reaction without any extra pumping over the period. The feasibility of NOA 63-based microfabrication is verified by demonstrating NOA 63 microfluidic platforms with antibody-immobilized beads for immunoassays. In chapter II, I present a simple and low-cost approach to the fabrication of enclosed hydrophilic nanofluidic channels by coating ultra-thin PDMS layer on the surface of nanostructures made of a NOA 63, and chemical bonding the PDMS-coated nanocahnnels to a glass substrate with oxygen plasma treatment. This simple process results in enclosed nanofluidic channels with high structural fidelity and hydrophilicity that is maintained for at least one month. In chapter III, micro- and nano-patterning are used for stem cell study. Mesenchymal stem cells (MSCs) can differentiate into multi lineage cells. Many research efforts have been focused on finding effective ways to selectively differentiate the pluripotent cells into defined lineage-committed progenitor cells suit to their use in regenerative medicine because of their plasticity and availability. Some reports showed that the topography in the surface where MSCs were attached to during culture had an influence on their cell fate. Other reports showed that the elasticitic property on the matrix where the cells encountered during the culture decided its switch on the cell lineage. In this study, I demonstrate these two parameters can affect simultaneously and independently the cell shape and alignment of actin cytoskeleton in MSCs by growing them on the substrates having grooves and ridge patterns with various dimensions fabricated in two polymers with different elastic properties, the soft elastomer PDMS and the hard epoxy photoresist SU8. The degree of the elongation of the cell body, orientation of alignment of actin cytoskeletons and also their organization varied from strong fiber to meshwork are dependent on matrix and dimension of the patterns. In chapter IV, 3D microfluidic cell culture systems offer a biologically relevant model to conduct micro-scale mammalian cell-based research and applications. Various natural and synthetic hydrogels have been successfully incorporated into microfluidic systems to support mammalian cells in 3D. However, embedment of cells in hydrogels introduces operational complexity, potentially hinders mass transfer, and is not suitable for establishing cell-dense, ECM-poor constructs. I present here a gel-free method for seeding and culturing mammalian cells three-dimensionally in a microfluidic channel. A combination of transient inter-cellular polymeric linker and micro-fabricated pillar arrays was used for the in situ formation and immobilization of 3D multi-cellular aggregates in a microfluidic channel. 3D cellular constructs formed this way are relieved of hydrogel embedment for cellular support. Two mammalian cell lines (A549and C3A) and a primary mammalian cell (mesenchymal stem cells) were cultured in the gel-free 3D microfluidic cell culture system. The cells displayed 3D cellular morphology, cellular functions and differentiation capability, affirming the versatility of the system as a 3D cell perfusion culture platform for anchorage-dependent mammalian cells. I would like to conclude that I successfully developed user-friendly micro- and nano-fluidic devices and miniaturized platforms for bioapplications. I hope that I could improve the platforms while pursuing my Ph.D. degree in the future.