Cell-based screening of Alzheimer's disease therapeutics by amyloid oligomer characterization

Abstract

알츠하이머 질환은 인지능과 행동능 두 가지에 모두 영향을 미치는 퇴행성 뇌질환이다. 이 질병은 잘못 접혀진 베타 아밀로이드 펩타이드들이 뇌 속에 침착되어 발생되는 단백질-접힘 질병으로 알려져 있다. 베타 아밀로이드 펩타이드 (Aβ)는 막관통 단백질인 아밀로이드 선구 단백질로부터 분해되어 생성되는 비정상적 부산물로 아직 기능이 명확하지 않다. 선행된 연구들에 따르면 Aβ의 여러 응집체들 중 올리고머 구조가 알츠하이머 질환에서 독성 인자일 가능성이 높은 것으로 밝혀졌다. 본 연구에서는 먼저 베타 아밀로이드의 형상 구조를 관찰하기 위하여 형광 공명 에너지 전달 현상을 이용한 새로운 아밀로이드 프로브, FL-Aβ11-25-Azulene, 를 개발하였다. 이 프로브를 베타아밀로이드에 staining 하여 형광 수명 이미징을 하므로써 서로 다른 pH와 온도에 따라 존재하는 micelle과 donut 구조를 관찰하였다. 다른 기법들로는 보통 micelle과 protofibril 구조를 구별하기 어렵기 때문에 본 연구에서 micelle 구조를 프로브하는 것은 의미가 크다. 더 나아가 FCS, AFM, FLIM의 기능을 동시에 가진 다기능 나노스코피를 이용하여 베타아밀로이드의 올리고머 구조를 분석하였다. FCS 데이터는 용액상에서 베타 아밀로이드 응집체가 나노에서 마이크론 스케일 크기의 다양한 응집체를 형성하는 것을 보여주었다. 안정한 베타 아밀로이드 입자를 준비하여 AFM으로 높이에 대한 정보를 얻고, FLIM으로 얻은 형광 수명에 대한 정보로 단백질 이차 구조를 알 수 있었다. 이러한 다양한 접근 방법으로부터 얻은 정보들은 fibril과 올리고머가 독립적인 형성 과정을 거친다는 것을 보여주었다. 독성 인자인 베타 아밀로이드 올리고머를 표적으로 삼는 것은 최근에 이용되는 불완전한 치료법들 가운데 알츠하이머를 완전히 치료할 가능성을 제공한다. 올리고머의 독성을 막고 세포사를 저해하기 위하여, 본 연구에서는 Memantine과 비슷한 구조를 가진 새로운 화합물을 검증하였다. 구조적인 변화는 원편광 이색성 분광 분석을 통해 관찰하였고, 살아 있는 해마 세포들의 세포사 속도를 비교하기 위하여 실시간 형광 수명 이미징을 도입하였다. Adamantane 유도체들은 앞서 분석한 올리고머의 이차구조를 변화시켰고, 이들 중 Memantine은 세포사를 촉진 시킨 반면에 화합물 TAMA는 세포사를 저해시켰다. 이러한 결과는 TAMA가 알츠하이머 질환을 위한 강력한 약물 후보물질임을 보여준다.;Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease characterized by progressive cognitive deterioration together with declining activities of neuropsychiatric symptoms or behavioral changes. AD has been identified as a protein misfolding disease due to the accumulation of abnormally folded amyloid beta protein in the brains of AD patients. Amyloid beta, also written Aβ, is a short peptide that is an abnormal proteolytic byproduct of the transmembrane protein amyloid precursor protein (APP), whose function is unclear but thought to be involved in neuronal development. An oligomeric structure of A? is one of the probable neurotoxic agent in AD. It has been investigated intensively as toxic species in AD pathology in pioneering research. In this study, we first developed a new FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) amyloid probe in order to study conformations of beta amyloids. Fluorescence lifetime imaging of Aβ oligomers stained with FRET amyloids demonstrated that micelle and donut structures both exist in different pHs and temperatures. These observations to probe the micellar structures are very meaningful that it is usually difficult to distinguish micelle and protofibril structure with other techniques. We then characterized these oligomeric Aβ structures by the multifunctional nanoscopy, which incorporates Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), Atomic Force Microscopy (AFM) and Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM). FCS data showed that various sizes of Aβ aggregates exist simultaneously in the solution phase, spanning from nm to ?m scale. Stable oligomeric Aβ nanoparticles were prepared and their topological details of Aβ aggregates were investigated by AFM, simultaneously with fluorescence lifetime information by FLIM. These various approaches show the independent pathway of fibril and oligomer. Targeting toxic beta amyloid oligomers provide a hope to cure AD among various recent therapies. Thus, we identified a new small synthetic molecule, which has a similar structure with Memantine, to block these oligomers and inhibit apoptosis process. Structural changes were monitored by Circular Dichroism (CD) and apoptosis rates were determined by real-time fluorescence lifetime imaging of live hippocampal cells. The molecule, TAMA, changed the stable secondary structure of oligomers, which is described here in detail, and reduced its neurotoxicity whereas Memantine promoted cell death. These results indicate that TAMA has a powerful potential as a new drug for AD.