Multi-functional confocal microscopy of nanobiomaterials on structured surfaces

Abstract

Nanobiotechnology is in the limelight of fusion technology. It is the act of physically examining chemical phenomenon through biomaterials. It was once called biophysical chemistry, but is now referred to as nanobiotechnology as it became similar to nano in size. It is now at a level in which one can observe each biomaterial characteristic in a single molecular scale rather than just the interaction between biomaterial and nanoenvironment. The volume of samples has decreased and the minimum intensity of detectable signals is becoming less and less. The main objective of nanobiotechnology is contributing to the development of life science in which humans ultimately benefit from. The act of creating a similar environment to the internal environment of the human body is accelerating the development of life science. A lab-on-a-chip is the accumulation of the latest nanobiotechnology. It is a combination and integration of fluidic elements, sensor components and detection elements to perform the complete sequence of a chemical reaction or analysis, including sample preparation, reactions, separation, and detection. This paper probes into the various characteristics of biomaterials through MEMS technology and home-built multi-functional confocal fluorescence microscope system. Part I observes the formation of DNA-dye complex by utilizing dimethyldiazaperopyrenium dication, which has the characteristic of its fluorescence lifetime value separating into three components when it intercalates with DNA. Utilizing microfabrication skills, micro and nano size structures were transferred on top of transparent cover glasses. By applying AFM and FLIM, the dye’s defects were overcome and the interactions between surface structures and DNA-dye complexes have been discovered. Small structures influence on formation of DNA-dye complexes. 70nm channels were restrictive nanoenvionment. More small complexes were produced and preferred to locate away from the channel. However, both size and location of the complexes were more affected in 2μm channels. Various size of patterning cover glasses could manufacture. As developing these techniques, the correlation with sample and nanoenvionment could investigate in depth. In Part II, the dynamics of live biomaterials were studied. Surface of cover glasses were prepared by two methods. SAM method and immuno-reaction between the antibodies and antigens were selected. Immobilized Escherichia coli O157:H7, bacteria well-known for O157 infection were observed through AFM and FLIM. Furthermore, through DLS and FCS, we researched the size and diffusion time of bacteria which has free movement in liquid solutions. In the bacteria experiment, we chose to use the GFP transformed bacteria rather than the fluorescent dye to arrive at the original nature of the bacteria. According to time lapse, live bacteria showed free diffusion and swam at the same time. Size distributions and diffusion times were obtained from living bacteria. Comparing these data with live bacteria which have no mobile activity could be good subjects in the future work. This series of events has direct application to swift detection technology of E. coli O157:H7. Research on biomaterials is rapidly increasing with the development of nanobiotechnology. As technology accumulates, we look forward to observing and analyzing the many unknown and undefined biomaterials in a single molecular scale.;나노 바이오 기술은 새로이 각광 받고 있는 융합 기술이다. 생 물질을 대상으로 하여 물리학적 방법으로 화학적 현상을 규명하는 것이 바로 그 핵심이다. 이전에는 생물리화학 이라는 명칭도 있었지만, 그 스케일이 나노 사이즈에 접근해가면서 나노 바이오 기술이라는 명칭을 얻게 되었다. 생 물질과 나노 환경과의 상호작용뿐만 아니라 생 물질 각각의 특성을 단분자 수준에서 관찰할 수 있는 수준에 이르렀다. 필요한 샘플의 양은 점점 줄어들고, 관측할 수 있는 신호의 세기는 점점 최소화 되어가고 있다. 생체 내의 현상에 접근하기 위하여 유사한 환경을 조성해주는 것도 결국엔 나노 바이오 기술의 궁극적인 목적인 인간을 이롭게 하는 생명과학 기술 발전에 이바지 하는 것이다. 측정하고자 하는 물질의 스케일만 작아지는 것이 아니라, 대상 물질 뿐만 아니라 반응, 측정이 모두 작은 스케일로 이루어 지는 것이 바로 chip 상의 실험실이라고 불리는 lab-on-a-chip 이다. 본 연구에서는 MEMS 기술을 이용하고, 직접 구성한 다기능 공초점 형광 현미경 장치를 적극적으로 활용하여 생 물질들의 여러 특성을 규명하였다. 다양한 측정 방법들의 융합을 이용하여 표적 물질들의 광학적, 물리 화학적 특성들을 관측하여 해석할 수 있었다. Part I 에서는, DNA 에 intercalation 되면 형광 수명 시간이 3 가지로 늘어나는 특성을 가진 dimethyldiazaperopyrenium dication 이라는 dye를 이용하여 DNA-dye 복합체의 형성을 관찰하였다. Microfabrication 기술을 적극 이용하여 마이크로, 나노 사이즈의 구조물들을 얇고 투명한 cover glass 위에 만들었다. 구조물들의 표면과 DNA-dye 복합체의 상호작용을 AFM, FLIM 방법을 이용하여 확인 할 수 있었고, dye 의 취약점을 보완하여 더 합리적인 결과를 얻을 수 있었다. 70 nm channel 은 다소 제한적인 환경이었는데, 비교적 작은 복합체들이 형성되었고, 구조물을 피해서 위치하는 경향을 볼 수 있었다. 그러나 2μm channel 에서는 구조의 영향을 더 많이 받아서 크기와 위치, 배열 등을 확인하였다. 다양한 크기의 channel을 제작하는 기술은 확보했으므로, 실험을 발전시키면 구조물과 복합체 형성의 상호작용을 심도 있게 연구해 볼 수 있다. Part II 에서는 실험을 조금 더 발전시켜 살아있는 생 물질을 표적으로 하여 동역학을 고찰하였다. SAM 방법과 항원-항체 반응을 이용하여 O157 전염병으로 잘 알려진 박테리아, E. coli O157:H7을 cover glass 표면에 modification 시킨 뒤 AFM, FLIM 을 이용하여 관측하였다. 그리고 더 나아가 DLS, FCS 방법으로 용액 상에서 운동성을 가지고 있는 박테리아의 크기를 측정해보고, 확산 시간을 연구하였다. 박테리아 실험에 있어서는 형광 dye를 쓰지 않고 유전적으로 GFP를 미리 처리해 놓은 박테리아를 이용하여 그 본성에 접근하려고 노력하였다. 시간 경과에 따라, 시간 경과에 따라 살아있는 박테리아들은 자유 확산과 운동을 동시에 보여주었다. 움직이는 박테리아를 통해 크기 분포와 확산 시간을 얻을 수 있었다. 이러한 data들을 살아있기는 하지만 운동 능력이 상실된 박테리아들과 비교해 보는 것도 좋은 주제가 될 것이다. 이러한 일련의 과정들은 O157 박테리아의 신속한 검출 기술과 직접적으로 연관될 수 있다. 이처럼 생 물질들을 대상으로 하는 연구들은 나노 바이오 기술의 발전과 맞물려 발전 속도가 굉장히 빨라지고 있다. 점점 기술이 축적되어 갈수록 아직 규명되지 않은 수많은 생 물질들을 단분자 수준에서 관측하고 해석할 수 있게 될 것이다.