Autophagy-Associated Regulatory Factors Modulating Myogenic Differentiation of Tonsil-Derived Mesenchymal Stem Cells

Abstract

Mesenchymal stem cells （MSCs） are essential cellular resources in regenerative medicine. Tonsil-derived MSCs （TMSCs） are particularly promising due to their robust proliferation and strong immunomodulatory activity, and their potential in skeletal muscle regeneration is increasingly recognized. However, donor-dependent variability in proliferation, differentiation potential and immunomodulatory function has emerged as a major barrier to reproducibility and therapeutic translation. Understanding the intrinsic mechanisms that give rise to these differences is therefore critical. Autophagy was selected as a candidate mechanism because it is a fundamental cellular stress‐response pathway that coordinates energy homeostasis, survival, and differentiation, and has been shown to critically regulate myogenic differentiation and apoptosis in stem and progenitor cells. To elucidate the mechanisms underlying this phenomenon, three specific objectives were pursued. First, the present examined whether donor-dependent variation in skeletal myogenic differentiation is associated with autophagy activity. TMSCs from four donors were induced to differentiate under identical conditions, yet they produced markedly different outcomes. Donor group Myo-High showed high Myogenin and Dystrophin expression, active autophagy and low apoptosis. In contrast, donor group Myo-Low displayed reduced myogenic marker expression, suppressed autophagy and elevated apoptosis. Pharmacological modulation further confirmed the causal role of autophagy; inhibiting autophagy weakened myogenic differentiation in Myo-High cells, whereas activating autophagy improved differentiation in Myo-Low cells. Second, this study investigated whether these differences originate at the undifferentiated stage. RNA-seq analysis revealed that POSTN and BEX1 were consistently upregulated in Myo-High donors at both the transcript and protein levels. These genes were therefore identified as candidate regulators reflecting donor-specific myogenic potential. Functional knockdown of POSTN or BEX1 in Myo-High cells significantly reduced autophagy activity and impaired skeletal myogenic differentiation, indicating that both genes are essential for maintaining high differentiation capacity. POSTN knockdown also reduced BEX1 expression, suggesting a regulatory relationship in which POSTN functions upstream of BEX1. Third, this study sought to clarify the molecular pathway through which POSTN influences autophagy and myogenic differentiation at the undifferentiated state. Prior studies suggest that POSTN promotes lineage commitment through signaling involving p-GSK3β （Ser9） and β-catenin. Consistent with this, the present found that POSTN knockdown decreased p-GSK3β （Ser9）, indicating impaired signaling activity. Reduced p-GSK3β （Ser9） is known to elevate BCL2 expression, and BCL2 inhibits early autophagy through its interaction with Beclin1. In this study, POSTN knockdown increased BCL2 expression, supporting the idea that POSTN regulates autophagy and myogenic potential through the POSTN–p-GSK3β （Ser9）–BCL2 axis. Together, these findings demonstrate that autophagy is a central determinant of donor-dependent differences in TMSC myogenic differentiation. They also show that POSTN serves as a critical upstream regulator and that donor-specific myogenic potential is already established at the undifferentiated stage. This mechanistic insight highlights the POSTN signaling axis as a potential molecular target for predicting or modulating differentiation capacity in future regenerative applications.;재생의학 분야에서 중간엽 줄기세포（mesenchymal stem cells, MSCs）는 다양한 조직 재생 치료제 개발의 핵심 원료로 활용되고 있다. 그 중에도 편도 유래 중간엽 줄기세포（Tonsil-derived MSCs, TMSCs）는 우수한 증식능과 면역조절 기능을 보유하여 다양한 재생의학 응용 가능성이 높다. 특히 근육 재생 분야에서 MSC 기반 치료제는 높은 안전성과 대량생산 가능성을 제공한다는 점에서 주목받고 있다. 그러나 최근 줄기세포 연구에서는 공여자 의존성（donor dependency） 현상이 실험 및 임상 적용 단계에서 중요한 문제로 대두되고 있다. 공여자 의존성 현상이란 동일한 세포 유형이라 하더라도 증식률, 분화능, 면역조절 기능 등 여러 생물학적 특성이 공여자마다 다르게 나타나는 현상을 의미한다. 이러한 차이가 어떤 세포 내 과정과 관련 있는 지, 미분화에서 이미 결정되었는지, 어떤 특정 신호에 의해 영향을 받는지에 대해서 명확한 이해가 필요하다. 이에 본 연구는 다음 세 가지 목표를 중심으로 수행되었다. 첫째, 공여자 간 골격근 분화 잠재력의 차이가 자가 포식（autophagy） 활성의 차이와 연관되는지를 규명하고자 하였다. 네 명의 공여자로부터 TMSCs를 확보하여 동일 조건에서 골격근 분화를 유도한 결과, 공여자에 따른 뚜렷한 분화 효율 차이가 관찰되었다. 분화 이후 세포 형태, 자가 포식 활성, 세포사멸 수준, 골격근 특이 마커 발현을 종합적으로 비교한 결과, 후기 골격근 분화 단계（TMSC-MC）부터 공여자 간 형태학적·분자적 차이가 명확히 나타났다. 공여자 ＃1, ＃2（Myo-High군）는 높은 Myogenin 및 Dystrophin 발현과 활발한 자가 포식 활성（p62 감소, LC3II 증가, ATG7 증가）을 보인 반면, 공여자 ＃3, ＃4（Myo-Low군）는 낮은 골격근 마커 발현과 자가 포식 억제 패턴（p62 증가, LC3II 감소）, 그리고 증가된 세포사멸（TUNEL, Caspase 3, 7, 8）을 나타냈다. 또한 자가 포식 억제제（Baf1） 처리 시 Myo-High군의 Myogenin, LC3II가 감소하였으며, 자가 포식 촉진제（5-Aza） 처리 시 Myo-Low군에서 Myogenin, LC3II가 증가하였다. 이는 자가 포식이 TMSC의 골격근 분화능을 결정하는 주요 조절 요인임을 시사한다. 둘째, 이러한 공여자 간 차이가 분화 이전 단계의 미분화 상태부터 존재하는지를 규명하고, 이를 매개하는 핵심 자가 포식 조절 인자를 도출하고자 하였다. Myo-High군（공여자 ＃1, ＃2 세포）과 Myo-Low군（공여자 ＃3, ＃4 세포） 2개의 군으로 구분하고 미분화 세포 상태에서 RNA-seq 분석한 결과, Myo-High 군에서 유전자, 단백질 단계에서의 POSTN 과 BEX1의 유의미한 발현 증가를 확인하였다. 이를 통해 POSTN과 BEX1이 골격근 분화 잠재력 차이를 반영하는 핵심 후보 유전자로 도출되었다. POSTN은 ECM 단백질로 조직 재생 및 분화 조절에 관여하며, BEX1은 myoblast 융합과 초기 근육 분화 프로그램의 핵심 조절자로 알려져 있다. Myo-High군을 대상으로 siRNA 기반 knockdown을 수행한 결과, POSTN과 BEX1 knockdown 모두 골격근 분화 마커 및 자가 포식 활성의 감소를 유발하였으며, 이는 결국 골격근 분화 실패로 이어졌다. 또한 POSTN knockdown 시 BEX1 발현도 함께 감소하여 POSTN이 BEX1의 상위 조절자 일 가능성을 확인하였다. 셋째, 도출된 인자가 미분화 상태에서 어떤 분자적 신호 축을 통해 골격근 분화와 자가 포식 활성에 영향을 미치는지를 규명하고자 하였다. 기존 연구에 따르면 POSTN은 골격근 재생 과정에서 ECM 재구성, 혈관 재형성, 근섬유 유지에 중요한 역할을 하며, 골분화 과정에서도 다양한 신호 축을 통해 분화를 촉진하는 것으로 보고되어 왔다. 그러나 이러한 연구는 주로 손상 후 조직 수준 또는 myoblast 단계에 집중되어 있으며, POSTN이 미분화 줄기세포 단계에서 골격근 분화능을 어떻게 결정하는지에 대한 분자적 기전은 알려져 있지 않았다. 본 연구에서는 POSTN–p-GSK3β （Ser9）–β-catenin 축이 골분화를 촉진한다는 선행 근거를 바탕으로 분석을 수행한 결과, POSTN knockdown 시 p-GSK3β （Ser9） 감소가 나타나 POSTN이 골격근 분화 조절에도 관여함을 시사했다. 또한 p-GSK3β 감소는 자가 포식 인자인 BCL2 증가를 유도하고, 이는 Beclin1과 결합하여 초기 자가 포식을 억제하는 것으로 알려져 있다. 실제로 본 연구에서도 POSTN knockdown 조건에서 BCL2 증가가 확인되었으며, 이를 통해 POSTN–p-GSK3β （Ser9）–BCL2 축이 미분화 단계에서 자가 포식 활성과 골격근 분화능을 조절하는 핵심 경로임을 규명하였다. 종합적으로 자가 포식이 공여자 간의 골격근 분화능을 결정하는 주요 요인임을 확인하였다. 또한, RNA-seq 분석을 통해 골격근 분화 잠재력을 조절하는 주요 자가 포식 인자 POSTN을 식별함으로써, 골격근 분화능이 이미 분화 이전 단계인 미분화 단계에서 결정된다는 것을 입증하였다. 이러한 인자들이 POSTN–p-GSK3β Ser9）–BCL2 축을 통해 골격근 분화를 조절하는 자가 포식에 영향을 주어 골격근 분화를 조절한다는 점은, 미분화 세포 상태에서 분화 잠재력을 예측하거나 조절할 수 있는 새로운 분자적 타깃을 제시한다.