Single-cell morphology-based approach to resolve macrophage state heterogeneity and transitions

Abstract

Macrophages are innate immune cells that critically regulate inflammation and tumor progression within the tumor microenvironment （TME）. Although macrophage polarization has traditionally been described as a binary M1/M2 process, it is now understood as a continuum of phenotypic states, limiting classification based solely on conventional markers. This limitation is particularly pronounced in tumor-associated macrophages （TAMs）, which display marked heterogeneity and plasticity. This study developed a single-cell morphology-based framework for macrophage state analysis. Quantitative imaging–based morphological profiling was performed on THP-1-derived M1, M2a, M2c macrophages using automated single-cell segmentation, morphometric profiling, and Preserving Heterogeneity （PHet）-based feature selection. This approach identified shared morphology-defined subclusters across polarized macrophage states while revealing subtype-specific enrichment patterns. The framework was further applied to macrophages exposed to distinct senescence-associated secretory phenotypes （SASPs）, which consist of diverse cytokines, chemokines, growth factors, and proteases with immunomodulatory activity. Morphology-based analyses predicted SASP-induced shifts in macrophage polarization states, and these predictions were subsequently corroborated by gene expression and surface marker analyses. Collectively, this study demonstrates that single-cell morphometric profiling provides a scalable image-based framework for resolving macrophage heterogeneity and tracking macrophage state transitions. This approach complements conventional marker-based analyses and offers potential utility for high-content phenotypic screening.;대식세포는 종양미세환경（tumor microenvironment, TME） 내에서 염증 반응과 종양 진행을 조절하는 핵심적인 선천면역세포이다. 대식세포 분극은 전통적으로 M1/M2의 이분법적 과정으로 설명되어 왔으나, 현재는 다양한 표현형 상태가 연속적으로 존재하는 과정으로 이해되고 있으며, 이로 인해 기존 마커에만 기반한 분류에는 한계가 있다. 이러한 한계는 높은 이질성과 가소성을 보이는 종양 관련 대식세포（tumor-associated macrophages, TAMs）에서 특히 두드러진다. 본 연구에서는 대식세포 상태 분석을 위한 단일세포 형태 기반 프레임워크를 개발하였다. THP-1 유래 M1, M2a, M2c 대식세포를 대상으로 자동화된 단일세포 segmentation, 형태계측학적 프로파일링, Preserving Heterogeneity（PHet） 기반 feature selection을 이용한 정량적 이미지 기반 형태 분석을 수행하였다. 이를 통해 분극된 대식세포 상태 전반에서 공유되는 형태 정의 하위 군집을 확인하였으며, 각 아형에 특이적으로 풍부한 형태학적 패턴을 규명하였다. 또한 이 프레임워크를 다양한 사이토카인, 케모카인, 성장인자 및 단백질 효소로 구성되어 면역 조절 활성을 갖는 서로 다른 노화연관 분비표현형（senescence-associated secretory phenotypes, SASPs）에 노출된 대식세포에 적용하였다. 형태 기반 분석은 SASP에 의해 유도되는 대식세포 분극 상태의 변화를 예측하였고, 이러한 예측은 이후 유전자 발현 및 세포 표면 마커 분석을 통해 뒷받침되었다. 종합적으로, 본 연구는 단일세포 형태계측학적 프로파일링이 대식세포 이질성을 해석하고 대식세포 상태 전이를 추적하기 위한 확장 가능한 이미지 기반 분석 프레임워크를 제공할 수 있음을 보여준다. 이 접근법은 기존의 마커 기반 분석을 보완하며, high-content 표현형 스크리닝에 활용될 수 있는 가능성을 제시한다.