Effects of Peripheral Iron Regulation on Aged-associated Changes in the Brain

Abstract

Background and objective: Aging is characterized by chronic low-grade inflammation, known as inflammaging, which is associated with brain damage. Systemic inflammation induces blood–brain barrier (BBB) disruption and endothelial dysfunction, leading to secondary injury of oligodendrocytes. These pathophysiological changes are associated with dysregulated iron metabolism via activation of the bone morphogenetic protein (BMP)–mothers against decapentaplegic homolog (Smad) signaling pathway. In the first part of the present study, the effects of low-dose lipopolysaccharide (LPS)–induced inflammation and the protective effects of the BMP antagonist noggin were investigated in vitro in brain endothelial cells and oligodendrocytes, both in normal and in oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R)-induced ischemic injuries. In the second part of the in vivo study, the effects of systemic administration of the iron chelator deferoxamine (DFO) were evaluated in normal and septic brains of aged mice to determine its therapeutic usefulness for brain health with aging. Materials and methods: For in vitro experiments, mouse brain endothelial (bEnd.3) and human oligodendrocyte (MO3.13) cells were cultured in monocultures or a Transwell co-culture system. Chronic inflammation was induced with low-dose LPS (10 ng/mL), and ischemic injury was simulated using OGD/R. Noggin (100 ng/mL) was co-administered with LPS to assess its protective effects. Cell viability, cytotoxicity, and transendothelial electrical resistance (TEER) were measured, and western blotting and immunofluorescence staining were performed to analyze tight junctions, iron metabolism, and myelin-related proteins. For in vivo experiments, aged (20-month-old) male mice were subcutaneously administered DFO (200 mg/kg/day) for 14 days via osmotic infusion pumps, followed by a systemic LPS injection (5 mg/kg, i.p.) to induce septic inflammation. Behavioral tests, western blotting, and immunofluorescence staining were performed to evaluate iron regulation, BBB integrity, myelination, microglial activation, and inflammatory cytokine expression. Results: In vitro models, LPS treatment of bEnd.3 cells reduced cell viability, increased cytotoxicity, and decreased TEER, accompanied by decreased expression of occludin and claudin-5. This endothelial dysfunction was accompanied with damage in co-cultured MO3.13 cells, characterized by iron dysregulation (increased hepcidin, ferritin, and TfR1), activation of BMP–Smad signaling, and decreased expression of myelin-related proteins (MAG, CNPase, and MBP). OGD/R further aggravated LPS-induced endothelial and oligodendrocyte injury. Noggin attenuated these pathological changes by inhibiting BMP–Smad signaling, thereby preserving BBB integrity, modulating iron metabolism, and restoring myelin-related protein expression. In vivo experiments demonstrated that DFO treatment in aged mice corrected brain iron dysregulation by reducing expression of hepcidin and ferritin, and increasing ferroportin expression. DFO also reduced microglial activation, modulated inflammatory cytokine levels, and improved age-related myelin loss, BBB dysfunction, and synaptic deficits. Furthermore, DFO attenuated the LPS-induced sepsis-associated behavioral dysfunction, neuroinflammation, and damage to myelin, tight junctions, and synaptic structures. Conclusion: This study demonstrated that chronic low-grade inflammation induces BBB disruption, iron dysregulation, and oligodendrocyte injury, thereby increasing the vulnerability of these cells to ischemic insults and sepsis. Noggin attenuates inflammation- and ischemia-induced endothelial dysfunction and oligodendrocyte damage in vitro by suppressing BMP–Smad signaling and stabilizing tight junction and myelin-related proteins. Systemic DFO treatment mitigated age-associated changes in the brain, thereby protecting from the effects of sepsis. These results suggest the importance of controlling inflammaging and iron metabolism for brain health in the elderly. Together, modulation of the BMP/Smad pathway and the use of iron chelators are beneficial in maintaining brain health against aging and age-associated brain diseases in the elderly.;연구 배경 및 목적: 노화는 염증노화라고 알려진 낮은 수준의 만성 염증 상태를 특징으로 하며, 이는 뇌 손상과 관련이 있다. 전신 염증은 혈액-뇌 장벽(blood–brain barrier, BBB)의 손상과 뇌혈관내피세포의 기능장애를 유발하고, 그 결과 희소돌기아교세포의 이차적 손상을 초래한다. 이러한 병태생리적 변화는 bone morphogenetic protein (BMP)-mothers against decapentaplegic homolog (Smad) 신호 전달 경로의 활성화에 따른 철 대사 조절 이상과 관련되어 있다. 본 연구의 첫번째 부분은 세포 배양 실험으로, 낮은 농도의 lipopolysaccharide (LPS)로 유도된 염증 조건의 정상 및 산소–포도당 결핍/재관류(OGD/R)로 유도한 허혈성 손상에서 뇌혈관내피세포주와 희소돌기아교세포주 손상에 미치는 영향을 분석하고, BMP 길항제인 noggin의 보호 효과를 평가하였다. 두번째 부분의 동물 실험에서는 정상과 패혈증을 유도한 노화 마우스의 뇌에서 철 킬레이터 deferoxamine(DFO)을 전신 투여하여, 노화에 따른 뇌 건강에 대한 유용성을 측정하였다. 연구 방법: 세포 배양 실험에서 마우스 뇌혈관내피세포주(bEnd.3)와 휴먼 희소돌기아교세포주(MO3.13)를 단일배양 또는 Transwell 공동배양 시스템에서 배양하였다. 저용량 LPS (10 ng/ml)로 만성 염증 상태를 유도하고, OGD/R로 허혈성 손상을 모사하였다. Noggin (100 ng/ml)을 LPS와 병용 투여하여 보호 효과를 평가하였다. 세포 생존율, 세포독성 및 경내피 전기저항(transendothelial electrical resistance, TEER)을 측정하였으며, 웨스턴 블롯과 면역형광 염색을 통해 치밀이음부, 철 대사 및 수초 관련 단백들의 변화를 분석하였다. 동물 실험에서는 노령(20개월령) 수컷 마우스에 삼투압 주입 펌프를 이용하여 14일간 DFO(200 mg/kg/day)를 피하 투여한 뒤, 패혈증을 유도하기 위해 전신으로 LPS(5 mg/kg; 복강 내 주사)를 투여하였다. 철 대사 조절, BBB 온전성, 수초화, 소교세포 활성화 및 염증성 사이토카인 발현을 확인하기 위해 행동 검사, 웨스턴 블롯, 면역형광 염색을 시행하였다. 연구 결과: 세포 실험에서, LPS 처리된 bEnd.3 세포는 세포 생존율 감소, 세포독성 증가, TEER 감소를 보였으며, occludin과 claudin-5 단백 발현이 유의하게 감소하였다. 이러한 뇌혈관내피세포 기능 장애는 공동배양된 MO3.13 세포의 손상과 동반되었으며, 철 대사 조절 이상(hepcidin, ferritin 및 TfR1 증가), BMP–Smad 신호 전달 활성화, 그리고 수초 관련 단백(MAG, CNPase 및 MBP)들의 발현 감소로 나타났다. OGD/R은 LPS로 유도된 뇌혈관내피세포 및 희소돌기아교세포 손상을 더욱 악화시켰다. Noggin은 BMP–Smad 신호 전달을 억제함으로써 병리학적 변화를 완화시켜 BBB 온전성 유지, 철 대사 조절 및 수초 관련 단백들을 회복시켰다. 동물 실험에서, 노령 마우스에 DFO 투여는 뇌의 hepcidin과 ferritin 발현 감소 및 ferroportin(FPN) 발현을 증가시켜 철 대사 조절 이상을 개선하였다. 또한, DFO는 소교세포 활성을 감소시키고 염증성 사이토카인 발현을 조절하며, 노화와 관련된 수초 손상, BBB 기능 장애 및 시냅스 결손을 개선하였다. 이와 더불어 DFO는 LPS로 유도된 패혈증 관련 행동 장애, 신경염증, 수초 및 치밀 이음부, 시냅스 손상을 완화시켰다. 연구 결론: 본 연구는 낮은 수준의 만성 염증이 BBB 손상, 철 대사 조절 이상, 그리고 희소돌기아교세포 손상을 유발하여 허혈성 손상 및 패혈증에 대한 취약성을 증가시킴을 규명하였다. Noggin은 BMP–Smad 신호 전달을 억제하고 치밀이음부 및 수초 관련 단백들을 안정화시킴으로써, 염증과 허혈에 의한 뇌혈관내피세포 기능 장애와 희소돌기아교세포 손상을 완화시켰다. DFO의 전신 투여는 뇌의 노화성 변화를 완화시켜 패혈증으로부터 뇌를 보호하였다. 이러한 결과는 노인의 뇌 건강을 위해 염증노화와 철 대사 조절이 중요함을 시사한다. 따라서, BMP–Smad 경로 조절과 철 킬레이터의 사용은 노화 및 노화성 뇌 질환으로부터 뇌 건강을 유지하는데 도움이 된다.