Dual-function agent IKK16 with antibacterial and anti-inflammatory activity

Abstract

The escalating prevalence of Gram-negative pathogens resistant to multiple antibiotics has become a serious global health concern, emphasizing the urgent necessity to maintain the therapeutic effectiveness of colistin, one of the few remaining treatment options. However, colistin monotherapy is limited by emerging resistance and dose-dependent toxicity, prompting the search for effective colistin adjuvants that enhance antibacterial activity while reducing inflammation. In this study, we screened adjuvant candidates against carbapenem-resistant Gram-negative strains and identified IKK16, previously known as an anti-inflammatory IKK inhibitor, as a potent colistin synergist. Checkerboard and time-kill assays confirmed that IKK16 markedly potentiated the bactericidal activity of colistin. Although IKK16 alone exhibited minimal activity or high MIC values against Gram-negative bacteria, it showed enhanced killing at lower concentrations as cells entered the growth arrest phase. Transmission electron microscopy revealed that IKK16 disrupted Acinetobacter baumannii ATCC19606 membrane architecture. Consistently, SYTOX Green uptake, ATP leakage, and protein leakage assays demonstrated a concentration-dependent increase in membrane permeability. Binding assays suggested that IKK16 interacts with the phospholipid layer of bacterial membranes, and treatment of Acinetobacter baumannii LpxC and Staphylococcus aureus MW2 cells further confirmed its membrane-disruptive action. IKK16 also exhibited bactericidal activity against MW2 persister populations, and co-treatment with gentamicin enhanced bacterial killing by promoting intracellular drug penetration. In the Caenorhabditis elegans model, IKK16 showed low systemic toxicity, and hemolysis assays confirmed its selectivity toward bacterial membranes. As an anti-inflammatory compound, IKK16 significantly suppressed the expression of TNF-α, IL-6, IL-1β in RAW264.7 macrophages stimulated with A. baumannii ATCC 19606, particularly in combination with colistin. Together, these findings demonstrate that IKK16 is a dual-function colistin adjuvant that exhibits strong antibacterial synergy and anti-inflammatory activity, representing a promising therapeutic candidate against A. baumannii ATCC19606 and MRSA infections.;다제내성 그람음성균의 급증은 전 세계적으로 심각한 공중보건 문제로 대두되고 있으며, 이에 따라 최후의 치료제로 사용되는 colistin의 효능 유지가 중요한 과제가 되고 있다. 그러나 colistin 단독요법은 내성 발현과 독성의 한계로 인해 치료 효율이 떨어지며, 이에 대한 보조제 개발의 필요성이 강조되고 있다. 본 연구에서는 콜리스틴 내성 그람음성균주를 대상으로 colistin과의 시너지를 유도할 수 있는 보조제를 스크리닝하던 중, 기존에 염증 조절 작용이 보고된 IKK 억제제 IKK16을 후보 물질로 선정하였다. Checkerboard assay와 time-kill assay를 통해 IKK16이 colistin과 병용 시 강력한 상승 효과를 보임을 확인하였다. 단독 처리에서는 그람음성균에 대한 MIC가 높거나 활성이 거의 없었으나, 균이 growth arrest phase로 전환될수록 낮은 농도에서도 더 빠른 살균을 유도하였다. Transmission electron microscopy 분석을 통해 IKK16이 세균 세포막 구조에 손상을 유도함을 확인하였고, SYTOX Green uptake, ATP 및 단백질 유출 분석에서도 농도 의존적 세포막 투과성 증가가 관찰되었다. Binding assay를 통해 IKK16이 세균 phospholipid 층에 결합함을 예측하였으며, 이를 바탕으로 A. baumannii LpxC 및 S. aureus MW2 균주를 대상으로 단독 처리 시 막 붕괴를 일으키는 것을 확인하였다. 또한 MW2의 persister 세포에서도 time-kill assay를 통해 살균 활성을 보였고, gentamicin과의 병용 시 세포 내 침투가 증가하여 살균 효율이 향상되었다. C. elegans 모델에서 IKK16은 높은 독성을 보이지 않았으며, hemolysis assay를 통해 세균 막에 대한 선택성이 우수함을 확인하였다. 염증 조절제로 개발된 IKK16은 A. baumannii ATCC 19606으로 자극된 RAW264.7 세포에서 colistin 단독 처리보다 병용 처리 시 TNF-α, IL-6, IL-1β 발현이 현저히 감소하였다. 이러한 결과를 종합하면, IKK16은 그람음성균에 대한 colistin 보조제로서 뛰어난 항균 시너지 및 항염증 활성을 동시에 나타내는 이중기능성 후보물질로, A. baumannii ATCC19606 및 MRSA 감염에 모두 적용 가능한 잠재력을 지닌다.