The effects of Chrysanthemi Flos and Zizyphi Semen extract on alleviation of insomnia and anxiety

Abstract

Chrysanthemi Flos (Chry) and Zizyphi Semen (Zizy) are known natural remedies with tranquilizing effects. This study aims to explore their medicinal potential for insomnia and anxiety disorders, both stress-related neuropsychiatric disorders. The sleep-prolonging effects of Chry and Zizy extracts (100, 200 mg/kg), along with their characterizing compounds linarin and jujuboside A (JuA) (5, 10 mg/kg), were evaluated in a pentobarbital-induced sleep mice model. Additionally, the effect of these extracts was examined on caffeine-induced insomnia in mice. To confirm the effect of these extracts on sleep structure and sleep quality, an electroencephalogram (EEG) analysis of rats was performed using the MATLAB algorithm. Additionally, western blot analysis and measurement of intracellular chloride influx were performed to confirm whether all these effects act through the gamma-aminobutyric acid (GABA)ergic system. The effects of the extracts on anxiety disorders were evaluated using two anxiety mice models, one induced by immobilization and another using a combination of immobilization and electric shock. The assessments included measuring behavioral improvements using the open field test (OFT) and elevated plus maze (EPM), as well as observing expression changes in glutamic acid decarboxylase (GAD)65/67, neurotrophic factors, and antioxidant factors in the frontal cortex using western blot analysis. Each administration of the extracts did not affect the locomotor activity of mice, but the extracts and their characteristic compounds significantly increased sleep duration compared to the pentobarbital alone group in the pentobarbital-induced sleep mice models. Furthermore, these extracts alleviated caffeine-induced insomnia in mice. The administration of Chry extract increased total sleep time and non-rapid eye movement sleep (NREMS) time in rats, notably enhancing the power density of delta waves in sleep EEG analysis. The administration of Zizy extract extended NREMS duration without inducing significant changes in the brain wave frequency. Both extracts regulated the expression of GABAA receptor subunits and GAD65/67 in specific brain regions (frontal cortex, hippocampus, and hypothalamus). Linarin and JuA increased intracellular chloride influx in human SH-SY5Y cells, and it was reduced by GABAA receptor antagonists. These results indicate that GABAergic regulation may be involved in the sleep-maintaining effects of both extracts. Regarding anxiety disorders, both extracts significantly alleviated anxiety behavior as measured by OFT and EPM in anxiety mice induced by the combination of immobilization and electric shock. They also restored the reduced expression of GAD65/67 and protein kinase B(Akt)/cyclic adenosine monophosphate (cAMP) response element-binding protein (CREB)/brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and enhanced antioxidative factors in the frontal cortex of mice. In summary, both Chry and Zizy extracts demonstrated sleep-prolonging properties, improved insomnia, and regulated sleep architecture through GABAergic system modulation. In addition, extracts alleviated anxious behavior, restored the expression of GAD65/67 and neurotrophic factors, and enhanced antioxidant factors in the frontal cortex of anxiety mice. These findings suggest that Chry and Zizy extracts have the potential as therapeutic agents for stress-related neuropsychiatric conditions such as insomnia and anxiety disorders.;국화 (Chrysanthemi Flos)와 산조인 (Zizyphi Semen)은 전통적으로 신경 안정 효과가 있다고 알려진 천연물이다. 본 연구의 목적은 국화와 산조인이 스트레스 기반 신경정신질환인 불면증과 불안 장애에 대한 효과를 규명하는 것이다. 국화 추출물과 산조인 추출물 (100, 200 mg/kg)과 이들의 특성 물질 중 하나인 linarin과 jujuboside A (JuA) (5, 10 mg/kg)의 수면시간 연장 효과를 펜토바르비탈 유도 수면 마우스 모델에서 측정하여 평가하였다. 또한, 카페인으로 유도한 불면증 마우스 모델에서도 국화 및 산조인 추출물이 불면증을 완화시키는지 확인하였다. 이들 추출물이 수면의 구조와 수면의 질 향상에 미치는 효과를 확인하기 위해 MATLAB 알고리즘을 이용하여 랫드의 뇌파 (EEG)를 분석하였고, 이 모든 효과들이 GABAergic 시스템을 통해 작용하는지 확인하기 위해 western blot 및 세포 내 염화물 (Cl-) 유입을 측정하였다. 두 추출물의 불안장애 치료 효과를 확인하기 위해 고정화와 고정화 및 전기 충격의 조합으로 유도한 두 가지 불안 마우스 모델을 사용하였다. 두 모델에서 open field test (OFT)와 elevated plus maze (EPM) 실험을 통해 두 추출물이 마우스의 불안 행동을 개선하는지 확인하였고, 전두엽 피질에서 GAD65/67의 발현 변화, 신경영양인자, 그리고 항산화 인자 발현 변화에 두 추출물이 어떤 영향을 미치는지 확인하였다. 펜토바르비탈을 주사하기 전 두 추출물의 투여는 마우스의 운동 활동에 영향을 주지 않았으며 수면 및 수면 이하 용량 모두에서 두 추출물과 각 특성 물질, linarin 과 JuA은 펜토바르비탈 단독에 비해 수면 시간을 연장했다. 또한 카페인으로 유도된 마우스의 불면증은 두 추출물 투여에 의해 완화되었다. 수면구조 측정을 위해 랫드를 이용하여 sleep EEG를 측정하였다. 국화 추출물의 투여는 랫드의 전체 수면시간을 증가시켰고 그중에서 NREM 수면의 시간을 향상시켰으며, 특히, 수면뇌파 중 델타 파장의 power density를 증가시켰다. 반면 산조인 추출물은 랫드의 뇌파에 큰 변화 없이 NREM 수면의 시간을 향상시켰다. 두 추출물 모두 랫드의 뇌 각 부위(전두엽, 해마, 시상하부)에서 GABAA 수용체의 소단위와 GAD65/67의 발현을 조절하였고, 각 지표물질인 linarin과 JuA는 SH-SY5Y 인간세포주에서 세포 내 염화물 유입을 증가시켰으며, GABAA 수용체에 대한 길항제 처리에 의해 감소됐다. 이러한 결과는 두 추출물의 수면 유지 효과가 GABAergic system의 조절 관여로 나타날 수 있음을 시사한다. 불안장애와 관련하여, 고정화와 전기충격으로 유도된 불안 마우스에서 두 추출물의 투여는 OFT와 EPM 실험 결과 불안 행동을 유의하게 완화시켰다. 두 추출물은 불안장애 마우스의 전두엽 피질에서 감소된 GAD65/67 및 Akt/CREB/BDNF 발현을 회복시켰고, 항산화 인자의 활성을 강화시켰다. 요약하자면, 국화와 산조인 추출물은 GABAergic 시스템 조절을 통해 설치류에서 수면연장 특성, 불면증 개선, 수면 구조 조절을 보여주었다. 또한, 두 추출물은 불안장애가 유도된 마우스의 불안 행동을 개선했으며, 전두엽 피질에서 GAD65/67 및 신경영양인자의 발현을 회복시켰으며, 항산화 인자의 발현을 강화시켰다. 이러한 발견은 국화 및 산조인 추출물이 불면증 및 불안장애와 같은 스트레스 관련 신경 정신 질환에 대한 치료 물질로의 잠재력을 가지고 있음을 시사한다.