AZD7648, a DNA-PKcs inhibitor, overcomes radioresistance in Hep3B xenografts under hypoxia

Abstract

현재 암은 세계적으로 두 번째로 높은 사망률을 야기하는 질병이며 지속적으로 발병률이 증가하고 있다. 최근에는 대부분의 암 치료 과정에서 방사선 치료가 적용되고 있지만 고선량의 방사선에 의한 독성 및 반복 치료에 의한 내성이 문제로 남아있다. 따라서 이러한 문제를 해결하기 위해서 방사선 민감제의 사용은 좋은 대안이 될 수 있다. 효과적인 DNA-PKcs 저해제인 AZD7648은 이미 방사선 조사와 병용하여 암의 성장 억제에 있어서 상승효과를 확인한 연구는 발표되었으나, 방사선 내성과 관련된 연구는 전무한 상태이다. 본 연구에서 Hep3B 간암 세포주 및 이종이식 동물 모델을 이용하여 AZD7648의 방사선 민감 효과 및 방사선 내성 극복에 대한 연구를 수행하였다. 먼저, 방사선 민감 효과 연구에서는 Hep3B 이종이식동물모델을 이용하여 선행연구에서 사용한 AZD7648 농도 (50-100 mg/kg)보다 낮은 20 mg/kg로 매일 경구투여 하였으며 음성대조군의 평균 종양 체적이 180 mm3이 되었을 때 종양부위만 2 Gy 용량으로 5회 국소 방사선 조사하였다. 음성대조군과 비교하여 AZD7648 단독 투여군은 종양 성장 억제효과가 없었고 방사선 단독 조사군은 종양 성장이 지연되었으나, AZD7648과 방사선 조사 병용군에서 상승적인 종양 억제 효과가 확인되었다. 모든 군에서 체중 변화에 대한 유의성은 없었던 것으로 보아, 이는 AZD7648과 방사선 조사의 병합 요법은 체중감소 등의 급성독성 없이 효과적으로 종양 성장을 억제시켰음을 나타낸다. 또한 Hep3B 암세포에 AZD7648 단독 처리시 세포 독성이 없는 약물 농도에서 AZD7648와 방사선 조사 병용군은 Hep3B 암세포의 증식을 억제하였고 방사선 조사에 의한 G2/M 세포주기 정지 세포의 축적을 증가시켰다. 방사선 조사에 의해 G2/M 세포주기 관문 단백질이 증가되었지만 방사선 조사와 병용된 AZD7648은 방사선 조사에 의해 증가된 G2/M 세포주기 관문 단백질의 발현을 감소시킴으로써 세포가 다음 단계로 나아가는 것을 제한하였다. 따라서, AZD7648은 독성이 없는 저농도에서 방사선 조사와 병용 시, 효과적으로 방사선 민감 효과를 유도한다는 것을 알 수 있다. 다음으로, 방사선 내성 개선 효과 연구에서는 방사선 민감 효능 연구와 달리, Hep3B 이종이식동물모델의 평균 종양 체적이 300 mm3까지 크게 성장한 종양에 8 Gy 용량으로 1회 국소 방사선 조사를 실시하였다. 그 결과, 방사선 조사에 의한 종양 성장 지연 효과가 전혀 없음을 확인하고, 더불어 이는 방사선 조사에 의한 내성이 발생하였다는 것도 알 수 있다. 흥미롭게도 방사선 내성이 생긴 Hep3B 이종이식동물모델에서 AZD7648과 방사선 조사 병용 시, 방사선 내성을 극복하고 통계적으로 유의하게 종양의 성장을 억제함이 확인되었다. 방사선 내성에 있어서 대표적인 원인으로 종양의 저산소증이 있으며 본 실험에서 추출된 종양을 이용하여 저산소증 유도 인자인 HIF-1α와 관련 단백질들의 발현을 비교 분석한 결과, HIF-1α 및 VEGF의 단백질 발현은 방사선 조사에 의해 증가하였으며 AZD7648이 방사선 조사에 의해 증가한 단백질 발현을 억제함으로써 저산소증에 의한 방사선 내성을 극복한 것을 확인하였다. 또한, CoCl2에 의해 저산소증이 유도된 세포에서도 방사선 조사에 의한 세포주기 정지 세포의 축적이 되지 않은 것으로 보아 방사선 조사에 의한 내성이 발생하였음을 확인하였고, AZD7648이 CoCl2에 의해 증가된 HIF-1α 및 PHD 단백질의 발현을 억제시켜 저산소증 환경을 개선시켜 주는 것임을 알 수 있었다. 본 연구 결과들을 통해 AZD7648은 정상 산소 상태에서는 세포주기 조절을 통해 방사선 민감 효과를 높이고 저산소 상태에서는 HIF-1α를 조절함으로써 방사선 내성에 대한 개선 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 이 연구는 AZD7648이 방사선 치료에 민감한 암 뿐만 아니라 방사선 치료에 내성이 있는 암에서도 방사선 치료와 병용할 수 있는 강력한 방사선 민감제로 제시한다.;Radiation therapy is one of the most commonly used cancer treatments, however, has important concerns such as damage to normal tissues around cancers and radioresistance. Combination therapy using radiosensitizer and radiotherapy will be a good alternative to overcome these problems. The present study investigated the effects of AZD7648 on overcoming radioresistance as well as radiosensitizing in Hep3B xenografts and cells. First, in in vivo Hep3B xenograft, AZD7648 combined with ionizing radiation (IR) synergistically suppressed tumor volume compared with IR in radiosensitive xenografts. Furthermore, combination treatment with AZD7648 and IR strongly inhibited tumor growth in radioresistant xenografts but not in radiosensitive xenografts. Radioresistant tumor upregulated HIF-1α and VEGF by IR, which were suppressed by combination therapy. VHL showed the opposite trend. Next, in in vitro study, AZD7648 alone was not cytotoxic, but AZD7648 combined with IR enhanced radiosensitivity by inhibiting clonogenic survival. Moreover, AZD7648 plus IR increased IR-induced G2/M arrest and modulated cell cycle checkpoint in normoxia but not in hypoxia. HIF-1α expression was not affected by AZD7648 in normoxia, however, AZD7648 downregulated HIF-1α expression level under CoCl2-treated hypoxic condition. It was also shown in PHD2 expression. In conclusion, AZD7648 synergistically accumulated IR-induced G2/M arrest in radiosensitive xenografts and regulated HIF-1α pathway in radioresistant xenografts. The present data suggest that AZD7648 may be a strong radiosensitizer in radioresistant as well as radiosensitive cancers.