Optogenetic control of Reactive oxygen species at the Golgi apparatus

Abstract

Optogenetic Control System은 빛을 조사하였을 때 단백질이 활성을 얻고, 다른 단백질과의 결합이 유도되는 성질을 이용하여 세포 신호전달의 변화를 매개하는 생명과학실험의 기법의 하나이다. 이 논문에서는 선행연구에서 Optogenetics에 적합하다고 알려진Arabidopsis thaliana의 blue light 광수용체인Cryptochrome(CRY)을 기반으로, 골지체의 ROS를 조절하는 Optogenetic Control System을 제작하였다. 기존의 식물체 내에서는 blue light에 쪼여졌을 때, CRY2 그리고CRY2과 결합하는 단백질인 CIB1의 결합이 유도되는 것으로 알려져 있다. 그러나 이들의 light-sensitive 한 부분인 CRY2의 PHR 도메인 그리고 CIB1의 N-terminal 부분인 CIBN 으로도 두 단백질의 dimerization이 유도되며, 그 결합력이 더 증가한다고 알려져 있다. 따라서, PHR 도메인에 mCherry, 붉은 형광 단백질과 카탈레이스를 클로닝 하였고, CIBN에는 EGFP, 초록 형광 단백질과 골지체에 결합하는 염기서열을 가지는 Giantin 클로닝하여 벡터를 디자인하였다. 이 두 벡터는 동시에 셀 내에 형질도입 하게 되면 발현이 충분히 된 이후, 488nm의 공초점 현미경 레이저에 의해 둘 사이의 결합이 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 같은 레이저 세기로 20초 간격 그리고 2분 간격으로 488nm 레이저를 조사해보았더니, 20초 간격이 2분 간격보다 훨씬 빠르게 결합이 유도되는 것을 확인했다. 이는 조사 간격에 따라 ROS의 농도를 시간에 따라 조절할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 두 단백질의 결합은 빛의 조사가 지속되면 그 결합이 유지되지만, 조사를 멈추게 되면 결합이 풀려 처음 상태로 돌아온다는 것을 확인하였다. 이는 실제 결합이 유발하는 세포 내 변화 또는 현상이 두 단백질의 결합이 풀렸다가 다시 결합하였을 때 재차 유도되는지를 확인함으로써 골지체 활성산소의 역할을 확실히 알 수 있을 것이다. 단백질 PHR-mCherry-Catalase의 카탈레이스 활성도를 카탈레이스 어쎄이와 immunoblotting을 통해 확인하였고, 그 활성도는 세포내에서 충분히 골지체의 활성산소 농도를 조절하는데 역할 할 수 있는 정도로 확인되었다. 마지막으로iRFP670 형광물질에 PtdIns(4)P과 결합하는 FAPP1-PH를 달아 세포 내PtdIns(4)P의 분포를 이미징으로 확인할 수 있게 하였다. 선행연구를 통해 알려진, EGF 자극이 유도하는 PtdIns(4)P의 골지체에서의 축적을, 디자인한 벡터를 이용하여 확인하여 보았고, 이후 Optogenetic Control System에 적용해, 골지체 특이적인 활성산소가 정확하게 조절되는지를 확인해 봄으로써 골지체 특이적인 활성산소를 Optogenetic하게 조절하는 메쏘드를 확립하는 것을 목표로 한다. 골지체 특이적인 활성산소가 조절되어 PtdIns(4)P의 축적에 변화가 일어나는 것을 확인한 이후에는, 이 system을 통해서 골지 특이적인 활성산소가 세포 내에서 어떤 역할을 하는지, 특별히 골지체의 가장 특징적인 기능인 단백질 분비 또는 세포막 단백질 trafficking에 얼마나 중요한 역할을 하는지 규명하는 데에 중요한 기법으로 이용될 것이라 예상한다.;Reactive oxygen species, especially hydrogen peroxide (H2O2) have been reported to act as signaling mediators implicated in cell proliferation, growth, and migration. In this study, I try to set up the method to identify the role of hydrogen peroxide (H2O2) at the Golgi by targeting a Catalase that removes H2O2 and regulating the amount of H2O2 through illuminating light. For the purpose of local H2O2 manipulation, I expressed CIBN (the N-terminal part of CIB whose bHLH domain has been removed in cryptochrome-interacting base-helix-loop-helix1)-EGFP-Giantin which binds to the Golgi and PHR (the minimal light-sensitive domain of Arabidopsis thaliana cryptochrome2)-mCherry-Catalase in HeLa cells. When cells were exposed to blue light, I investigated the dynamic movement of mCherry-Catalase. I observed blue light-induced Golgi targeting of mCherry-Catalase or mCherry (control) in live HeLa cells. Quantitative analysis of red fluorescence at the Golgi showed the targeting of mCherry increased dependent on blue light intensity and illuminating period. Next, I measured PHR-mCherry-Catalase activity in the cells which had been transfected with the plasmid. I expressed PHR-mCherry-Catalase in Catalase knock-out MEF (mouse embryonic fibroblast) cells and measured Catalase activity of the lysates with Amplex Red H2O2 detection method. I found that Catalase activity increased dependent on the expression of PHR-mCherry-Catalase. I established the method of the blue light-induced Golgi targeting of Catalase and am investigating how PtdIns(4)P, a key phosphoinositide for membrane and protein trafficking at the Golgi is controlled by endogenous H2O2 generated in response to EGF stimulation. We are analyzing Golgi PtdIns(4)P level in A431 cells expressing iRFP670-FAPP1-PH (PtdIns(4)P sensor), PHR-mCherry-Catalase and CIBN-EGFP-Giantin with the use of three-color confocal live cell imaging. This optical control of Golgi H2O2 can give a clue to elucidate a new role of reactive oxygen species at the Golgi apparatus.