Novel small-molecule selective UCH-L1 inhibitors derived from Bakuchiol as anti-metastatic drug candidates

Abstract

Tumor metastasis is a major reason for the treatment failure of cancer patients. However, a specific category of antimetastatic drugs are missing in current anticancer therapy. Ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (UCH-L1), one of the deubiquitinating enzyme (DUB) family, is known to be overexpressed in various metastatic cancers and its hydrolase activity is crucial for tumor invasion and metastasis. In order to develop the selective and effective UCH-L1 inhibitor, we screened chemical and natural product libraries (> ~1000 molecules) and found (S)-Bakuchiol, extracted from the seed of Corylifolia Fructus, as a lead compound. After further optimization, one of the bakuchiol derivatives (HYL-BK-032) has been demonstrated as a selective inhibitor on UCH-L1 hydrolase activity. HYL-BK-032 significantly suppressed cell migration and invasion of highly invasive human lung cancer cell NCI-H157. In orthotropic mouse model, HYL-BK-032 significantly reduced both metastasis of B16F10 melanoma cells to the secondary sites and primary tumor growth without any in vivo toxicities. This inhibition was confirmed by causing the suppression of focal adhesion signaling pathways involving metastatic process including adhesion, migration and invasion. This study suggests that HYL-BK-032 as a novel selective UCH-L1 inhibitor can be a potential therapeutic candidate for metastatic cancers.;Ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (UCH-L1)은 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinating enzyme, DUB)에 해당하는 단백질로 폐암, 유방암, 전립선암 등 다양한 암세포에서 특이적으로 과발현되어 있다고 보고되었으며, 특히 종양 전이를 조절할 수 있는 우수한 신규 치료 표적으로 제안되었다. 이전 선행 연구를 통해 본 연구진은 UCH-L1을 선택적으로 저해하여 보다 효과적이고 생체 내 독성이 나타날 가능성이 적은 후보 물질을 찾고자, 약 1000여 개 이상의 화합물 라이브러리를 스크리닝하여 천연물 유래 바쿠치올(Bakuchiol)이 UCH-L1을 L3 대비 선택적으로 저해함을 발견하였다. 이번 연구는 구조 활성 분석을 기반으로 합성된 바쿠치올 유도체 중 HYL-BK-032가 UCH-L1 선택적 저해제로서 종양 전이 억제 효과를 가지고 있음을 확인하였다. Ub-AMC를 효소기질로 한 UCH-L1 효소 활성 실험에서, HYL-BK-032는 그 모핵 구조인 바쿠치올 또는 기존의 UCH-L1 억제제 물질인 LDN 57444보다 훨씬 더 효과적으로 UCH-L1의 효소 활성을 억제하였다. 한편 폐암 세포 H157의 생장에는 UCH-L1을 억제하는 효능보다 대략 26배 더 큰 저해 농도 수준을 보임으로써, HYL-BK-032 처리 시 고농도에서만 인간 폐암 세포 NCI-H157을 사멸시킨다는 사실을 밝혔다. 따라서, 폐암 세포를 효율적으로 사멸시키는 급성 세포 독성이 없기 때문에 시스플라틴과 같은 종래의 세포 독성 항암제와 병용하면 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. UCH-L1의 효소 활성은 종양의 침습 및 이동에 매우 중요하며, 특히 암 전이를 조절할 수 있는 단백질로 이전 연구를 통해 보고된 바 있다. 따라서 UCH-L1 저해제인 HYL-BK-032를 통해 암 전이를 억제할 수 있는지 생체 내 생체 외 실험들을 통해 확인하였다. 그 결과, HYL-BK-032는 H157 세포주의 이동성과 침습성을 농도 의존적으로 효과적으로 억제하였다. 또한, 이어 시행한 비교대조분석을 통해 HYL-BK-032가 LDN 57444 또는 (S)-바쿠치올보다 우수 또는 유사한 정도의 세포 이동 억제 효능을 가짐을 밝혔다. 세포 수준에서 확인된 HYL-BK-032의 전이 억제 효능은 동물 종양 모델에서도 확인되었다. 발바닥 부위에 쥐 흑색종 세포를 이식하여 종양 모델을 만들고, 약 10일 뒤부터 2주간 HYL-BK-032를 종양 부위에 주 3회 투여하였다. 종양 이식 31일째 림프절과 폐의 전이 정도를 평가함으로써 HYL-BK-032 투여군이 대조군과 비교해 2차 부위로의 종양 전이가 억제되었음을 확인하였다. 또한 조직 분석적으로도 종양 전이 정도에 유의미한 차이가 발견되었다. 더하여 원발성 종양의 부피는 HYL-BK-032 투여에 따라 상당히 감소하였고, 이때 개체 체중의 변화는 관찰되지 않았다. 더하여 HYL-BK-032의 생체 내 독성을 확인하기 위한 동일 모델의 생존 분석에서, 대조군과 투여군 사이에 유의한 차이가 없음이 확인됨으로써 HYL-BK-032가 마우스 모델에서 생존에 치명적인 생체 내 독성은 없는 것으로 증명되었다. HYL-BK-032가 세포 침습 및 이동과 전이를 억제하는 기전에 대해서 알아보기 위해, HYL-BK-032 처리 후 H157 세포주의 focal adhesion 신호 전달 경로를 분석하였다. 그 결과 주요 신호 전달 단백질인 FAK과 Paxillin의 인산화가 HYL-BK-032에 의해 농도의존적으로 감소하였음을 확인하였다. 또한 HYL-BK-32 처리 시 세포 가장자리 부분의 Paxillin, 즉 focal adhesion complex의 형성에 관여하는 Paxillin의 양이 감소되었음을 확인하였다. 이를 통해 HYL-BK-032가 세포 부착(adhesion)을 억제함으로써 암 세포의 침습 및 암 전이를 억제하는 효과를 보일 가능성이 제시된다. 본 연구를 통해 HYL-BK-032이 종양 전이를 효과적으로 억제함이 증명되었으며, 이로써 새로운 암전이 억제제 후보 물질을 도출하였다는 데에 그 의미가 있다. 또한 HYL-BK-032는 새로운 종류의 선택적 UCH-L1 억제제이며, 현저한 독성이 발견되지 않았기 때문에 이전 UCH-L1 저해제 개발의 한계점을 극복할 가능성이 있다. 본 연구는 전이성 폐암을 포함한 UCH-L1 관련 질환에 대한 후속 연구들에 새로운 가능성을 제시하며, 나아가 알려지지 않은 종양 전이의 메커니즘을 이해하는 데에도 잠재적으로 도움이 될 수 있다.