Structure Based Design and Synthesis of Selective JAK1, TRAP1, and QC Inhibitors

Abstract

PART Ⅰ. Development of JAK1-Selective Inhibitors Based on Rational Design JAK kinases play a critical role in cytokines-mediated inflammatory and autoimmune reactions through JAK/STAT signaling. Especially, JAK1 kinase is engaged in most of signaling, mediated from γc cytokines, Gp130, IRF family and IL-10-like cytokines, which leads JAK1 as a potential target protein to treat for several inflammatory diseases such as inflammatory bowel disease and rheumatoid arthritis. Here, We designed and synthesized N-alkyl substituted 1-H-pyrrolo[2,3-b]pyridine carboxamide derivatives through the structure based computational study of the well-known JAK inhibitors(tofacitinib and filgotinib). Diverse cycloalkyl amino groups containing the benzyl groups were introduced at the C4 of N-alkyl substituted 1-H-pyrrolo[2,3-b]pyridinecarboxamide for SAR studies. Among them, 4-(((2R,4R)-1-(4-chlorobenzyl)-2-methylpiperidin-4-yl)amino)-N-methyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-5-carboxamide showed remarkable efficacy (IC50= 0.13nM, 10-fold vs tofacitinib's IC50) and JAK1 selectivity (14, 26 and 34-fold vs JAK2, JAK3 and TYK2, respectively). Its potency (IC50=10 nM) and selectivity (100-fold vs JAK2, JAK3 and TYK2) were even enhanced in cell-based assay compared to tofacitinib (tofacitinib's IC50= 151 nM). A kinase panel assay confirmed that this compound does not show potency to most kinase species except tyrosine kinases including JAK family at 1 μM. PART Ⅱ. Structure Based Design and Synthesis of TRAP1-Selective Inhibitors Hsp90s family has been considered as one of potential target proteins to treat for cancers. Among them, TRAP1 is located in mitochondria, a hub of cellular survival, unlike other Hsp90 family. It has been reported that TRAP1 is exuberantly expressed in tumors of breast, lung, pancreas and prostate, but not overexpressed in normal cells. Here, we focused on development of TRAP1, a mitochondrial Hsp90 paralog. Catching on to the previous study, we designed and synthesized pyrimidinylpyrrolidinone derivatives whose potency and selectivity for TRAP1 might have chance to enhance. Especially, 2-amino-4-chloro-7-(3,4-dichlorobenzyl)-5,7-dihydro-6H-pyrrolo[2,3-d]pyrim idin-6-one displayed the best potency and selectivity for TRAP1 against Hsp90α (IC50 for TRAP1= 81.5 nM and >60-fold selectivity against Hsp90α). We additionally performed its docking study to clarify enhanced activity and selectivity for TRAP1. CO of pyrrolidinone plays a key selectivity switch by directly interacting with N171 of TRAP1, but not with L107 of Hsp90α. PART Ⅲ. Synthesis of QC/iso-QC Inhibitors Substituted with Additional Pharmacophoric Side Chain QC/iso-QC catalyze the cyclization of N-terminal glutamine (Gln) into pyroglutamate (pGlu), leading to stabilizing protein conformation. It is notably reported that QC/iso-QC are overexpressed in chronic disease patients such as Alzheimer’s disease and fibrosis by cyclizing the N-terminals of Aβ and CCL2, stable conformations. We designed new scaffold of QC/iso-QC inhibitors containing 1,3,4-thiadiazol-2-amine groups as a zinc binding part, aromatic rings being located in the hydrophobic region of QC and linkers with cycloalkyl or aromatic rings positioned at outside, improving binding affinity. From SAR studies of Zinc binder fragments, 1,3,4-thiadiazol-2-amine were chosen as a Zinc binder. As a result of introduction of some benzyl rings substituted with linkers, 5-(1-(3-methoxy-4-(3-(piperidin-1-yl)propoxy)benzyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amine were showed the best potency even compared with the compound without linkers (1.4-fold). Moreover, we performed the docking studies of it and compared one, resulting in cycloalkyl groups interacting with F325 of QC and other pharmacophores working equally with compound without linkers.;PART Ⅰ. Development of JAK1-Selective Inhibitors Based on Rational Design JAK1 kinase는 JAK/STAT 신호전달을 통하여 여러 cytokine들에 의해 매개되는 염증과 자동면역반응에 관여한다. 따라서 JAK1 저해제는 염증성 장질환이나 류마티스 관절염과 같은 다양한 염증성 질환들을 치료하는데 사용되고 있다. 우리는 이미 개발되어진 물질인 tofacitinib과 filgotinib의 구조적 특징을 참고하여 N-alkyl substituted 1-H-pyrrolo[2,3-b]pyridinecarboxamide 유도체를 설계 및 합성하였다. N-alkyl substituted 1-H-pyrrolo[2,3-b]pyridinecarboxamide의 C4 위치에 벤질그룹을 가지고 있는 여러 종류의 질소를 포함하는 고리형 탄소기들을 도입하여 구조-활성 상관관계를 확인하였다. 그 중에서도 4-((cis-1-(4-Chlorobenzyl)-2-methylpiperidin-4-yl)amino)-N-methyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-5-carboxamide 화합물은 기준물질인 tofacitinib 대비 JAK1에 대하여 10배 정도의 주목할 만한 효능을 보였으며 다른 JAK kinase들과 비교하여 10배 이상의 높은 선택성을 보였다. 선택성은 세포환경에서 다른 JAK kinase 대비 JAK1에 대하여 100배 이상 더 향상됨을 보였다. 추가로 진행한 kinase 패널분석을 통하여 tyrosine kinase에 속하는 소수의 kinase를 제외하고 대부분의 kinase에 대해 활성을 거의 보이지 않음을 확인하였다. PART Ⅱ. Structure Based Design and Synthesis of TRAP1-Selective Inhibitors 단백질의 항상성을 유지하는데 큰 역할을 하는 Hsp90는 암 치료에 대해 좋은 타겟 단백질 중의 하나로 여겨진다. 그중 TRAP1은 다른 Hsp90 family들과 달리 세포의 생존에 중요한 역할을 하는 마이토콘드리아 안에 존재한다. 이는 또한 전립선암, 유방암, 대장암 등에서 과발현되는 것으로 보고된다. 우리는 Hsp90들 중 마이토콘드리아에 존재하는 TRAP1을 저해하는데 초점을 두었다. 선행 연구를 통하여 TRAP1에 대해 이전보다 높은 효능과 선택성을 가질 것으로 보여 진 pyrimidinylpyrrolidinone 유도체를 설계 및 합성하였다. 생물활성 측정을 통해 2-amino-4-chloro-7-(3,4-dichlorobenzyl)-5,7-dihydro-6H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-one 화합물이 TRAP1에 대하여 높은 효능과 (IC50= 81.5 nM) Hsp90α대비 60배 이상의 선택성을 보이는 것을 확인하였다. 높은 활성 및 선택성을 이해하기 위해 TRAP1의 분자도킹 모의실험을 진행하였다. 그 결과 pyrrolidionone의 카보닐기가 Hsp90α와는 결합을 하지 않지만 TRAP1의 171번에 위치한 Asn과 직접적인 수소결합을 함으로써 선택성의 중요한 스위치 역할을 하는 것을 확인하였다. PART Ⅲ. Synthesis of QC/iso-QC Inhibitors Substituted with Additional Pharmacophoric Side Chain QC/iso QC는 글루타민의 고리화를 촉매하여 다양한 단백질들의 구조적 안정을 유도한다. 특히나 QC/iso QC는 Aβ 또는 CCL2 단백질의 N 말단의 글루타민의 고리화를 통한 각 단백질의 구조적 안정성을 유발시켜 알츠하이머 질병, 섬유화 등의 만성적 질병에 관여한다고 보고된다. 우리는 zinc 결합자로써 1,3,4-thiadiazol-2-amine기, QC의 소수성 구역에 위치할 방향족 고리, QC 단백질의 외곽에 위치하여 결합 친화력을 높여줄 끝에 고리형 알킬기가 있는 링커를 도입한 새로운 구조의 저해제를 설계 및 합성하였다. 그 결과 5-(1-(3-methoxy-4-(3-(piperidin-1-yl)propoxy)benzyl)-1H-benzo[d]im idazol-5-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amine 화합물이 링커가 도입되지 않은 화합물 대비 1.4배의 효능을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 추가적으로 사슬 도입의 효과를 확인하고자 새로 합성한 화합물과 사슬이 도입되지 않은 화합물의 분자도킹 모의실험을 진행하였다. 그 결과 링커 끝에 있는 고리형 알킬기는 QC 단백질의 외곽에 위치하며 325번에 위치한 페닐알라닌과 소수성 결합을 해 단백질에 대해 높은 결합능을 유도함을 확인하였다.