Functional analysis of Escherichia coli putative transporter YbbY in the allantoin and glyoxylate metabolism operon

Abstract

Many microorganisms possess metabolic pathways to utilize purines as a nitrogen source. These purine metabolic pathways produce urea, glyoxylate, and oxamate via allantoin degradation pathway. Among these intermediates, allantoin is the first metabolite with significant solubility, making its study critical for understanding uric acid degradation and its implications for various diseases. In Escherichia coli (E. coli) genes related to allantoin and glyoxylate metabolism are organized in a cluster. This study aimed to elucidate the function of YbbY, a unknown transporter protein within this cluster. Using a gclp-lacZ reporter gene fusion, the expression of the ybbY gene was analyzed. Under aerobic conditions, high activity was observed when glycolate or glyoxylate was provided as a carbon source. Under anaerobic conditions, high activity was observed only when glyoxylate was provided as the carbon source. Additionally, when allantoin was used as a nitrogen source, increased activity was detected in both aerobic and anaerobic conditions. Promoters upstream of the gcl, glxR, allW, and allB genes were predicted based on GC content analysis, then transcripts were verified through RT-PCR. Under aerobic conditions with glycolate, polycistronic transcripts were formed as part of the gcl operon, specifically in the combinations gcl - hyi - glxR - allW - allB - ybbY and allW - allB - ybbY - glxK. Under anaerobic conditions with allantoin, transcripts in the combinations gcl - hyi - glxR - allW and allW - allB - ybbY - glxK were formed. The ybbY deletion mutant was constructed to assess its functional role. The mutant strain exhibited significantly accelerated growth compared to the wild type strain (WT) under anaerobic conditions with glyoxylate. Correspondingly, glyoxylate consumption was also higher in the mutant strain. In silico analyses, including protein structure prediction and interaction studies, were conducted. Using AlphaFold2, it was predicted that YbbY forms a homodimer. However, no interactions between YbbY and other enzymes involved in glyoxylate metabolism, such as Gcl, Hyi, GlxR, AllW, AllB, and GlxK, were identified. Although the ligand for YbbY remains unknown, this study concludes that YbbY interacts with glyoxylate metabolic enzymes to inhibit glyoxylate utilization under anaerobic conditions. Further studies are needed to identify the precise interaction partners and clarify its role in glyoxylate metabolism.;많은 미생물들은 질소원으로 퓨린을 대사하는 경로를 가지고 있다. 이러한 퓨린 대사는 알란토인을 거쳐 요소, 글라이옥실산, 그리고 옥사메이트를 생산한다. 알란토인은 퓨린 대사 산물 중 용해성을 가지는 첫 번째 물질로, 알란토인에 대한 연구는 요산 분해와 다양한 질병의 연구에 더 깊은 이해를 위해 필요하다. 대장균의 알란토인과 글라이옥실산 대사에 관련된 유전자들은 서로 이웃하여 클러스터를 이루고 있다. 이 연구는 이러한 유전자 집합에 속한 YbbY의 기능을 밝히고자 하였다. ybbY 유전자의 발현을 gclp-lacZ을 통해서 확인한 결과, 호기 환경에서는 글리콜산 또는 글라이옥실산을 탄소원으로 제공햇을 때 높은 활성도를 보였다. 혐기환경에선는 글라이옥실산을 탄소원으로 제공한 경우에만 높은 활성도를 나타냈다. 그리고 알란토인을 질소원으로 제공하였을 때 혐기와 호기 환경에서 활성도가 증가하였다. DNA에서 GC 염기의 비율을 통해 gcl, glxR, allW, 그리고 allB 유전자 상류에 촉진유전자가 있을 것으로 예측하였으며 RT-PCR을 통해 전사체를 검증하였다. 호기환경에서 글리콜산과 배양하였을 때 gcl 오페론에서 ybbY 유전자는 gcl - hyi - glxR - allW - allB - ybbY 와 allW - allB - ybbY - glxK의 조합으로 다시스트론성 전사체를 형성하였다. 혐기환경에서 알란토인과 배양하였을 때에는 gcl - hyi - glxR - allW 와 allW - allB - ybbY - glxK의 조합으로 다시스트론성 전사체를 형성하였다. ybbY 유전자 삭제 돌연변이 균주를 제작해 글라이옥실산과 혐기환경에서 야생형에 비해 돌연변이 균주의 성장이 급격하게 가속화되었다. 그리고 이에 상응하여 글라이옥실산의 소모량도 상대적으로 많이 소모하였다. 단백질 구조 예측과 단백질간의 상호작용을 in silico 분석을 통해서 진행하였다. Alphafold2를 이용하여 YbbY 가 동종이합체를 형성할 것으로 예측하였다. 하지만 YbbY와 Gcl, Hyi, GlxR, AllW, AllB, 그리고 GlxK와의 상호작용은 발견할 수 없었다. 비록 수송 단백질인 YbbY의 리간드는 알아낼 수 없었으나, 이 연구를 통해 YbbY가 글라이옥실산 대사 효소들과 상호작용해 혐기환경에서의 글라이옥실산 활용을 저해한다는 결론을 도출하였다. 정확한 상호작용 대상이나, 글라이옥실산 대사에 미치는 영향 밝히기 위한 후속 연구를 진행하여야 한다.