Therapeutic effect of Histone deacetylase 6 inhibitor for a mouse model of Phenylketonuria

Abstract

Introduction: Phenylketonuria (PKU), a metabolic disorder caused by mutations in the phenylalanine hydroxylase (PAH) gene, presents clinical symptoms such as mental retardation and hypopigmentation. The PKU mouse model, Paheun2, carries a missense mutation in the PAH gene, making it suitable for research targeting misfolded proteins resulting from mutations. Histone deacetylase 6 inhibitor (HDAC 6i) are being investigated as a potential treatment for various neurodegenerative diseases due to its ability to increase the degradation of misfolded proteins. In this study, we aimed to evaluate whether the action of a HDAC 6i in degrading misfolded proteins could improve clinical symptoms in the PKU mouse model. Materials and methods: The experiment was conducted by dividing subjects into a wild- type control group, a sham group administrated with dimethyl sulfoxide (DMSO), and HDAC 6i- treated group for 12 weeks. Tubastatin A (TSA) hydrochloride, HDAC6i was given at a dose of 50 mg/kg via intraperitoneal injection twice a week to Paheun2 mice. Every four weeks, serum phenylalanine concentrations were measured, and fur color was compared. The therapeutic potential of HDAC6i was evaluated through expression of the molecular chaperon protein Heat shock protein (HSP)90 and acetylated HSP90 by Western blot analysis. Results: At 12 weeks after treatment, a change in fur color to black was observed in Paheun2 mice administrated TSA. The plasma phenylalanine concentration in Paheun2 administrated with TSA significantly reduced compared to the sham group. Furthermore, we observed the increased expression of HSP90 in liver of treated PKU mice. Conclusion: These results indicated that treatment with HDAC6i ameliorated PKU symptoms in the animal model, suggesting therapeutic effects involving HSP90 acetylation. HDAC 6i could be considered a therapeutic candidate for the treatment of PKU. Further studies are needed to explore appropriate drug concentrations over a longer period of experimentation.;페닐케톤뇨증(Phenylketonuria, PKU는 페닐알라닌을 타이로신으로 전환시키는 효소 phenylalanine hydroxylase(PAH)의 돌연변이에 의한 유전 대사 질환이다. 이 질환은 페닐알라닌과 그 대사산물이 체액과 뇌에 축적되어 지능장애, 경련, 행동장애, 담갈색 모발, 피부의 색소결핍 등의 임상증상을 초래하게 된다. 현재 치료는 평생 저 페닐알라닌 식이를 하는 것으로 혈중 페닐알라닌 수치를 낮게 유지하는 방법이 있다. 그러나 이 증상만으로는 증상이 호전되지 않는 경우도 있고, 성인까지 이러한 식이요법을 하는 것에 어려움이 있으며, 임신 중에도 태아에 영향을 끼치는 문제도 가지고 있다. PKU와 같은 단일 유전자 질환에서 완치에 가까운 잠재력이 있는 유전자 치료를 통한 치료법이 연구되고 있으나, 그 안정성과 효용성에 대한 한계가 있으며 비용이 매우 높은 단점이 있다. 이 연구에서는 PKU Mouse model 중 하나인 Pahenu2 mouse를 이용하여, Histone deacetylase 6 (HDAC 6) 저해제의 잘못 접힌 단백질 (misfolded protein) 분해를 억제하는 작용이 돌연변이 된 PAH 단백질을 안정화시켜 PKU Mouse model에서 임상 증상 호전에 효과가 있을지 평가해보고자 하였다. 동물 실험은 이화여자대학교 동물 실험 윤리위원회의 지침에 맞게 진행하였다. 실험에 사용한 동물 모델은 PAH 결핍 수컷 생쥐로 PAH 유전자의 다음과 같은 과오 돌연변이(missense mutation)가 있으며, Paheun2 , PAH: c.835 T>C (p.F263S)와 Wild type BTBR 수컷 생쥐 계통을 사용하였다. HDAC 6 inhibitor는 Tubastatin A hydrochloride를 사용하였으며, 용매로 Dimethyl Sulfoxide (DMSO)를 사용하였으며, 혈중 페닐알라닌 농도 분석을 위해 Phenylalanine assay Kit를 사용하였다. Paheun2 mouse를 세 그룹으로 나누어 DMSO 투여군, Tubastatin 50 mg/kg 투여군으로 나누어 주 2회 복강 내 투여하였으며, 4주마다 Wilde type control과 털색 및 페닐알라닌 농도를 비교하였다. 12주간의 투약 후 실험은 종료하였다. HDAC 6 inhibitor의 치료 효과 평가를 위해 샤페론 단백질 HSP 90의 발현과 PAH 단백질 분석을 웨스턴 블롯을 통해 분석하였다. 페닐알라닌 농도 분석 결과 HDAC 6 저해제를 50 mg/kg 투여한 PKU 생쥐의 혈장 페닐알라닌 농도는 1297.93 μM이었으며, 12주간 주사 후 페닐알라닌 농도는 765.93 μM으로 감소하였다. 털 색 또한 점진적으로 회색에서 검은색으로 변하였다. 용매 DMSO만 투여한 군에서는 혈청 페닐알라닌 농도의 변화가 없었으며 털 색의 유의미한 변화도 관찰되지 않았다. HDAC 6 저해제를 투여한 PKU 생쥐에서 웨스턴 블럿 분석을 통해 아세틸화된 HSP 90 단백질이 유의하게 증가하였으며 PAH 단백질 발현도 같이 증가한 것을 관찰하였다. 이 결과는 HDAC 6가 PKU mouse model에서 misfold 된 PAH 단백질의 degradation을 억제하는 효과로 PKU 증상을 개선하였음을 나타내며 HSP 90 아세틸화가 치료 기전에 포함되는 것을 시사하고 있다, HDAC 6 저해제는 페닐케톤뇨증 치료를 위한 후보물질로 고려될 수 있음을 본 연구를 통하여 보여주었다. 추가적으로는 더 긴 실험 기간을 적용하여 치료에 적절한 약물 농도를 탐구하기 위한 연구가 필요할 것으로 사료된다.