Functional Characterization of DIA1 as a Putative Secreted Protein Tyrosine Kinase Candidate

Abstract

Cascades of intracellular protein phosphorylation play pivotal roles in cell signal transduction, and they are involved in the regulation of numerous biological processes including cell proliferation, survival, differentiation, and metabolism. Proteomic analyses of secreted proteins indicate that roughly 45% of all secreted proteins contain phosphorylated tyrosine (pTyr) residue. Although it has been proposed that phosphorylation of secreted proteins would alter the function of secreted proteins as is the case for intracellular proteins, little is known about the functional significance of tyrosine phosphorylation to secreted proteins. Our lab has shown that VLK acts a secreted protein tyrosine kinase. Subsequently, VLK kinase activity has been shown to play important roles in bone development, lung development, and axon guidance. However, it is unlikely that VLK alone is responsible for tyrosine phosphorylation of roughly 45% of all secreted proteins and bioinformatical analyses suggested that there are several secreted protein tyrosine kinase candidates based on their amino acid sequences. They include proteins of Fam69 (Fam60A, Fam69B, Fam69C) and DIA1 (DIA1 and DIA1R) families. Among the secreted protein tyrosine kinase candidates, I decided to investigate the function of DIA1. DIA1 is expressed in developing limbs, most abundantly in proliferating chondrocytes. In this study, I have confirmed that DIA1 is present in the secretory pathway and outside of the cell. secreted out of cells. Knockdown of DIA1 in U2OS osteosarcoma cells changed the cell morphology to more elongated cells. It is likely that DIA1 knockdown cause U2OS cells to adapt myocyte-like fate as mesenchymal cells can differentiate to osteoblast, adipocyte, and myoblasts and, among these cell types, only myoblasts have elongated morphology. I then examined whether DIA1 can affect the differentiation of mesenchymal cells. DIA1 indeed inhibited the differentiation of osteoblasts and adipocytes in C2C12 and 3T3-L1 cells. I have also examined whether DIA1 can alter the status of tyrosine phosphorylation in secreted cells. However, no noticeable change of tyrosine phosphorylation pattern between DIA1 and kinase-defective DIA1 mutant was found. These results suggest that DIA1 may act as a secreted protein kinase and regulate differentiation of mesenchymal cells.;세포 내 단백질 인산화 캐스케이드는 세포 신호 전달에 중추적인 역할을 하며 세포 증식, 생존, 분화 및 대사를 포함한 다양한 생물학적 과정의 조절에 영향을 미친다. 분비된 단백질의 단백체학적 분석에 따르면 모든 분비 단백질의 약 45%가 인산화된 티로신 잔기를 포함하고 있다. 세포 내 단백질의 경우처럼 분비된 단백질의 인산화가 분비 단백질의 기능을 변화시킬 것이라고 제안되는 것에 비해 분비 단백질에 대한 티로신 인산화의 기능적 중요성에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 우리 연구실에서는 VLK가 분비 효소 단백질로써 작용한다는 것을 밝혀냈다. 그 결과, VLK 효소 활성은 뼈 발달, 폐 발달, 축삭 지도에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 그러나 VLK만으로는 45%의 모든 분비 단백질 티로신 인산화를 책임질 가능성은 낮다. 생물정보학 분석에 따르면 아미노산 서열에 따라 여러 분비 단백질 티로신 효소 후보가 있는 것을 알려졌다. 여기에는 Fam69 (Fam60A, Fam69B, Fam69C) 및 DIA1 (DIA1 및 DIA1R) 계열의 단백질이 포함된다. 이 연구에서는 티로신 분비 효소 단백질 후보 중에서 DIA1의 기능을 조사한다. DIA1은 발달하는 사지에서 발현되며, 증식하고 있는 연골세포에서 풍부하게 발현된다. 연구를 통해 DIA1의 분비 경로와 세포 외부에 존재한다는 것을 확인했으며, U2OS 골육종 세포에서 DIA1의 효소 비활성 돌연변이가 세포의 형태를 길어지게 변화시킨다는 것을 관찰했다. 중간엽 세포가 조골세포, 지방세포, 근모세포로 부화할 수 있고, 이 세포 유형 중 근모세포만이 이러한 형태를 가지고 있기 때문에 DIA1 비활성 효소 돌연변이가 근모세포와 같은 운명을 가지도록 만들 가능성을 제기한다. 그 다음 DIA1이 중간엽 세포의 분화에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사했다. DIA1은 실제로 C2C12 및 3T3-L1 세포에서 조골세포와 지방세포로의 분화를 억제했다. 또한 DIA1이 분비된 세포에서 티로신 인산화 상태를 변화시키는지도 조사하였으나, DIA1와 DIA1 돌연변이 사이의 티로신 인산화 패턴 사이에 눈에 띄는 변화를 발견하진 못했다. 이러한 결과는 DIA1이 분비 효소 단백질로 작용하여 중간옆 세포의 분화를 조절할 수 있음을 시사한다.