Nuclear delivery of genomic medicines via the nucleocytoplasmic transport mechanism of snRNPs

Abstract

Genome editing is a genetic engineering approach that removes or replaces existing DNA by breaking DNA strands using nucleases that target specific DNA sequences in the genome. Clinical applications of genome editing have evolved with the development of technologies such as first-generation transcriptional activator-like effector nucleases (TALENs), second generation zinc finger endonucleases (ZFNs), and third-generation CRISPR Cas9. Of these, CRISPR Cas9 has gained attention because it uses RNA that binds complementary to DNA, making it simple and inexpensive to produce. In CRISPR-Cas9, sgRNA binds to Cas9, which accurately recognizes the sequence of the target gene and causes double-strand breaks (DSB) to knock out or knock in the gene. However, in clinical practice, the genome editing efficiency of CRISPR-Cas9 is not that high. Another type of gene therapy such as oligonucleotide therapeutics works by using RNA and DNA to regulate the expression of specific genes or modulate the expression of target proteins. They are relatively safe and transient because they do not affect the DNA of the existing genome. Since they can bind complementary to their target gene or mRNA, this approach offers theoretically unlimited target selection. Oligonucleotide therapeutics include antisense oligonucleotides (ASOs), short interfering RNAs(siRNAs), aptamers, etc. Among them, ASOs work through several mechanisms, some of which directly target pre-mRNAs in the nucleus. Therefore, it is important to enhance the nuclear transport of ASOs for efficient gene regulation. Nucleocytoplasmic transport of endogenous molecules is essential for the survival of eukaryotes. Nuclear proteins move from the cytoplasm to the nucleus through interactions with import receptors using nuclear localization signals (NLS). Some RNAs, called spliceosomal U rich small nucleolar RNAs (U snRNAs), utilize multiple signals for nuclear import or export in the form of small ribonucleoprotein complexes (snRNPs) to become mature snRNPs. Mature snRNPs bind to pre-mRNAs to form spliceosomes, which are essential for splicing of pre mRNAs. In Chapter 1, we show that the 5' 2,2,7-trimethylguanosine (m3G) cap, which acts as a nuclear import signal for snRNPs, binds to sgRNAs to enhance the genome editing efficiency of CRISPR Cas9. During the maturation of snRNPs, the m3g cap acts as a nuclear import signal to induce nuclear trafficking of snRNPs. We incorporated this nuclear import signal, m3g cap, with sgRNA prepared by in vitro transcription. Nuclear transport and genome editing efficiency of m3g capped sgRNA was investigated by evaluating the knockout of green fluorescent protein (GFP) expression of the GFP reporter cell line, KB-GFP cells. In Chapter 2, the study focused on synthetic U1 adapters, which are bifunctional oligomers designed to enhance the nuclear transport of antisense oligonucleotides (ASOs). The synthetic U1 adapter was designed to consist of a 'U1 domain' that binds complementary to the U1 snRNA of U1 snRNPs and a 'target domain' that binds complementary to the target pre-mRNA. During maturation of U1snRNPs, U1 snRNAs form a m3g cap and sm core, which will act as a signal for nuclear translocation, by the SMN complex. Nusinersen is an ASO therapeutic that suppresses alternative splicing by interfering with the binding of splicing machinery proteins to Intronic Splicing Silencer (ISS) sequences, restoring specific exons that are crucial for the expression of SMN proteins. Here, we investigated different chemical modifications of Nusinersen and examined exon inclusion efficiency of these ASO through employing synthetic U1 adapters.;유전자 치료제는 핵산 기반 의약품으로 특정 유전자를 표적으로 상보적으로 결합하여 작용한다. 이 기술은 이론적으로 표적 선택의 제한이 없어 미충족 의료수요를 충족시킬 수 있는 차세대 신약 기술이다. 그중 유전자 편집 기술은 게놈에서 표적 DNA를 삽입, 제거, 변형 및 치환하는 기술이며, 1 세대 TALEN, 2 세대 ZFN, 3 세대 CRISPR Cas 순으로 발전해 왔다. 이 중 CRISPR Cas 은 DNA 와 상보적으로 결합하는 RNA를 사용하여 비교적 간단한 유전자 편집이 가능하다는 점에서 주목을 받고 있다. CRISPR Cas9는 표적 유전자의 특정 염기서열을 정확하게 인식하는 sgRNA와 Cas9 핵산분해효소로 구성되고, 결합된 이들이 핵내에서 표적 유전자에 이중가닥 절단을 일으키고 복구하는 과정을 통해 표적 유전자를 제거하거나 추가적인 유전자를 삽입하면서 가공된다. 그러나 임상에서 CRISPR-Cas9의 유전자 편집 효율은 높지 않다. 또 다른 유전자 치료제인 핵산 치료제는 핵산을 사용하여 특정 유전자의 발현을 조절하는 방식으로 작용한다. 이는 게놈의 DNA에 영향을 주지 않기 때문에 안정성이 높고 표적 선택에 제한이 없다. 핵산 치료제에는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 압타머 등이 있다. 이중 ASO는 다양한 메커니즘을 통해 작동하며, 그 중 일부는 핵 안에 존재하는 전구체 RNA(pre-mRNA)를 표적으로 한다. 따라서, 이러한 ASO의 핵 수송율을 증가시키는 것은 중요하다. 핵과 세포질간수송에 따른 소형핵리보핵산단백질(snRNP)의 성숙은 진핵 생물의 생존에 필수적인 생체내 합성과정이다. 소핵 RNA(snRNA)는 snRNP의 구성요소로, 핵 수입 또는 수출 신호 및 다양한 단백질을 활용하여 성숙한 snRNP 로 가공된다. 성숙한 snRNP는 pre-mRNA 에 결합하여 스플라이소좀을 형성하고 이는 pre-mRNA 가 mRNA 로 가공되는 과정에 필수적인 스플라이싱을 처리한다. 유전자 치료제의 가장 큰 기술적 난제는 DNA를 핵내로 정확하게 전달하는 것이다. 1 장에서는 snRNP의 핵 수입 신호로 작용하는 m3G cap 을 sgRNA 에 시험관내 전사(IVT)로 결합하여 핵 수송을 유도하고, 유전자 편집 효과를 확인하였다. 그 결과, m3G cap에 따른 유의미한 유전자 편집 효율은 나타나지 않았고, m3G cap 이 snRNP의 핵 수송에 단독 신호로 작용하지 않음을 확인하였다. 2 장에서는 snRNP의 핵과 세포질간수송 작용을 활용하여, 핵과 세포질을 이동하는 snRNA에 상보적으로 결합하는 U1 domain 과 ASO 가 연결된 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 구조체 ‘synthetic U1 adaptor’를 합성하였다. 세포주에서 U1 domain의 핵 국소화를 확인하였고, ASO 의 화학적 변형을 비교하여 Locked nucleic acid(LNA) 변형된 ASO의 약물 효과가 가장 높은 것을 확인하였다. 최적화된 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 구조체는 단일 ASO, 세포내 어떤 구조와도 결합하지 않는 서열이 ASO에 연결된 구조체를 대조군으로, ASO 작용 효율이 비교 평가되었다. 그 결과, 시간이 지남에 따라 고농도에서 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 구조체의 ASO 작용 효과가 향상되었다. 본 논문을 통해 새로운 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 구조체는 핵 수송 전달체로써 다양한 유전자 치료 분야에서 활용될 가능성을 보였다.