Experimental study on the effect of aquaporin 4 inhibitor TGN-020 in atrial fibrillation

Abstract

Background: Atrial fibrillation (AF) is among the most common persistent arrhythmias. The association between aquaporin 4 (AQP4) channel regulation and heart failure with preserved ejection fraction or ischemic heart disease from the perspective of cell edema has been studied. However, little is known about its association with AF. We hypothesize that AQP4 channel regulation might have a protective effect in AF. This study aimed to explore the relationship between AF and AQP4 expression in vitro and in vivo levels and investigate the potential of AQP4 as a therapeutic target in AF. Materials and Methods: The experiment used HL-1 cells (full name, atrial cardiomyocytes). The cells were classified into the control group, angiotensin II (Ang II)-treated AF group, and Ang II + AQP4 blocker (TGN-020)–treated AF group. Mice were used for the in vivo experimental model, with 40 mice divided into the control group, Ang II-treated group, Ang II and AQP4 blocker–treated group, and Sham control group (treated with Ang II and phosphate-buffered saline). Immunofluorescence, RT-PCR, and dynamic Ca2+ confocal imaging were performed to investigate differences in the in vitro model, and a histologic examination and transthoracic echocardiography were performed in in vivo model. Furthermore, cardiac electrophysiology test was performed in the in vivo model to confirm AF inducibility. Results: When compared with the Ang II group, fibrosis markers (mRNA expressions of TGF- β1, MMP9, and MMP2) decreased in the Ang II + AQP4 blocker group (2.3±0.3 vs. 1.0±0.1, 2.6±0.3 vs. 1.3±0.1, 2.2±0.1 vs. 1.1±0.1, p<0.001). This trend was also consistent in immunofluorescence staining. In Ca2+ release imaging, the Ang II + AQP4 blocker group had a low regular intensity. For the in vivo experimental model, the heart in Ang II and Sham control groups was bigger than that in control and Ang II + AQP4 blocker groups (0.17±0.1 g and 0.16±0.1 g vs. 0.11±0.0 g and 0.13±0.1 g, p<0.01), but no significant differences were found when comparing heart weight relative to body weight. In the in vivo model of rapid atrial pacing with an intracardiac catheter, AF was induced in 7 out of 10 mice in the Ang II group after 2-second burst pacing. In contrast, only 1 of the 10 mice in the Ang II + AQP4 blocker group showed AF induction. The control group did not show AF induction even with burst pacing, while the sham control group exhibited induced AF in 6 out of 10 mice. The expression patterns of fibrosis markers (MMP2, MMP9, Col1α, and Col3α) were confirmed by RT-PCR, and this trend was consistent with that in the in vitro experiment. Conclusions: This study showed that AQP4 blocker treatment in vitro and in vivo has a protective effect on AF. We expect that this finding will shed light on further studies for the precise association between AF and AQP4 channel regulation. ;연구 배경: 심방세동은 임상에서 마주치는 가장 흔한 부정맥 중 하나이나 그 병태생리의 기전이 명확히 다 밝혀진 것은 아니다. 아쿠아포린 4 (AQP4) 채널은 심장 세포 부종의 관점에서 여러 심혈관질환, 특히 박출률 보존 심부전 또는 허혈성 심질환과의 연관성이 연구된 바 있다. 현재까지 AQP4 채널과 심방세동의 연관성에 대해서는 알려진 바가 적다. 이에 AQP4 채널의 조절이 심방세동의 진행을 억제하여 병의 진행으로부터 보호효과가 있을 것이라고 가정하였다. 이에 본 연구에서는 심방세동과 AQP4 채널 발현 사이의 연관성을 찾고 심방세동의 잠재적 치료 표적으로서의 AQP4 채널의 가능성을 실험적으로 검증하고자 하였다. 실험 방법: 세포 실험의 경우, HL-1 세포 (Atrial Cardiomyocytes)를 사용하였으며 각 세포는 대조군, 안지오텐신 II (Ang II)를 처리한 심방세동 유도군, Ang II와 AQP4 차단제를 같이 처리한 군으로 분류하였다. AQP4 차단제는 TGN-020을 사용하였다. 생체 내 실험모델을 위해 마우스를 사용하였으며, 총 40마리의 마우스를 대조군, Ang II 처리군, Ang II와 AQP4 차단제를 같이 처리한 군과 음성대조군 (Ang II와 PBS를 같이 처리한 군)의 4 그룹으로 나누었다. 세포실험에서 각 군의 차이를 확인하기 위하여 면역형광염색과 RT-PCR, dynamic Ca2+ confocal imaging을 사용하였다. 생체 내 실험모델에서의 각 군의 차이를 확인하기 위하여 조직염색과 심초음파를 시행하였으며, AF 유발을 확인하기 위하여 전기생리학 검사를 시행하였다. 결과: HL-1 세포실험에서, Ang II 와 AQP4 차단제를 같이 처리한 군은 섬유화 정도를 나타내는 마커 (TGF-β1, MMP9 및 MMP2)의 mRNA발현이 감소하였으며 (2.3±0.3 v.s. 1.0±0.1, 2.6±0.3 v.s. 1.3±0.1, 2.2±0.1 v.s. 1.1±0.1, p<0.001) 면역형광염색에서도 이러한 결과는 일관된 경향성을 보였다. Calcium confocal image에서 AngII와 AQP4 차단제를 같이 처리한 군은 규칙적이고 낮은 강도의 칼슘스파이크가 관찰되었다. 마우스 실험에서, Ang II 처리군과 Ang II와 PBS를 같이 처리한 군의 심장은 대조군이나 AQP4 차단제를 같이 투약한 군과 비교하였을 때 더 컸다(0.17±0.1g 및 0.16±0.1g vs. 0.11±0.0g 및 0.13±0.1g, p<0.01). 그러나 이러한 차이는 각 마우스의 체중에 대비하여 상대적 무게를 확인하였을 때 유의한 차이를 보이지 않았다. 또한, 심장내 카테터를 사용하여 빠르게 심방자극을 준 결과 (Rapid atrial pacing) Ang II 처리군의 10마리 마우스 중 7마리에서 심방세동이 유발되었다. 반면, AngII과 AQP4 차단제를 같이 처리한 군에서는 10마리의 마우스 중 1마리만이 심방세동이 유발되었다. 대조군에서는 버스트 페이싱(burst pacing)에도 불구하고 심방세동이 유도되지 않았으나, 음성 대조군에서는 10마리중 6마리의 마우스에서 심방세동이 유발된 것이 확인되었다. Real-time PCR을 통해 섬유화 표지자인 MMP2, MMP9, Col1α, Col3α의 발현양상을 확인하였고, 세포실험에서와 같은 경향성을 확인할 수 있었다. 결론: 본 연구는 세포실험과 생체내 실험 모델을 통해 AQP4 채널의 발현을 억제하는 것이 심방세동의 발병과 진행을 제한시킬 수 있다는 증거를 제시하며, 이는 AQP4 채널의 조절이 심방세동의 기전에 주요한 역할을 한 다는 것을 확인하였다. 심방세동 병태생리의 어떤 단계에서 AQP4 채널이 주요 역할을 하는지에 대한 정확한 정보는 얻지 못하였으나, 세포 부종 측면에 주목하여 추후 추가적인 후속연구에 응용할 수 있을 것으로 예상한다.