Development of biodegradable ionizable lipids and its application on the preparation of engineered platelets

Abstract

Lipid nanoparticles (LNPs) have become a crucial delivery system for mRNA-based therapeutics after the impressive results achieved with COVID-19 vaccines [1, 2]. This advancement had led to extensive research into mRNA-based cell therapies; however, there are still several challenges that need to be addressed. For mRNA therapeutics to work effectively in the body, it is essential to deliver them precisely to the target cells and ensure proper mRNA expression. LNPs administered intravenously are recognized by cell receptors and taken up through endocytosis, primarily due to the presence of proteins absorbed on the LNP surface. The effectiveness of intracellular expression relies on the mRNA/LNP complex's capability to break free from the endosome [3]. The process is heavily influenced by ionizable lipids, an essential component of LNPs [4]. Herein we will explore ionizable lipids as a potential solution to surpass the current limitations of LNPs. Our previous study has shown that the structure of ionizable lipids and the presence of biodegradable groups in their lipid tails can significantly alter the usage of LNPs [5]. In this study, we synthesized and screened novel ionizable lipid candidates that have biodegradable thioether groups in their tails. We then identified the most promising candidates based on their effectiveness. In comparison to FDA-approved commercial LNPs, these biodegradable LNPs demonstrated similar levels of protein expression, decreased hepatotoxicity, and better endosomal escape capabilities. We effectively transfected these newly developed LNPs into platelets which can be readily activated by any circumstances. Additionally, we demonstrated long-term expression of fluorescent mRNA, indicating the successful delivery of genes to suspension cells. Our new biodegradable LNPs have overcome the challenges that come with current cell therapies failing in suspension cells like monocytes. They show promise for further research into a wide range of therapeutic uses.;지질나노입자(LNP)는 COVID-19 백신 성공 이후 mRNA 기반 치료제의 핵심 전달 플랫폼으로 부상하였다. 이를 통해 백신뿐 아니라 mRNA를 기반으로 하는 많은 세포치료제 연구들이 진행되고 있지만 여전히 해결해야 할 과제들이 존재한다. mRNA 치료제가 체내에서 제대로 작동하기 위해서는 표적하는 세포로 정확한 전달 및 발현이 이뤄져야 한다. LNP는 세포내 흡수(endocytosis) 라는 기전을 통해 세포 내부로 들어가게 되고, 이는 주로 정맥 주사를 통해 들어간 LNP 표면에 흡착된 코로나 단백질에 의해서 결정된다. 세포 내 발현은 엔도좀을 통해 들어간 mRNA/LNP가 엔도좀을 잘 탈출하는 것에서 기인하는데 이때 가장 큰 영향을 미치는 것이 이온화 지질이다. 이온화 지질은 LNP의 네가지 구성성분 중 하나로, 주위 pH에 따라서 전하가 바뀌게 되는 특징이 있다. 본 연구는 이온화 지질의 구조와 지질 꼬리에 포함된 생분해성 기단의 종류에 따라서 LNP의 사용 목적이 크게 달라지게 됨을 확인한 기존 연구 결과를 토대로 진행되었다. 우리는 이온화 지질 꼬리에 생분해성 황화기가 포함된 새로운 이온화 지질 후보들을 합성하고 스크리닝을 통해 가장 효과가 뛰어난 후보를 선정했다. 이렇게 선택된 생분해성 LNPs는 FDA 승인을 받아 상업적으로 사용되는 LNPs에 비하여 높은 엔도좀 탈출 능력을 보이고 낮은 간독성을 보이면서도 비슷한 수준의 단백질 발현 능력이 있음을 보였다. 독성이 낮고 세포에 적은 영향을 준다는 특징을 활용하여 쉽게 활성화가 일어나는 혈소판(platelet)에 LNP를 성공적으로 유전자 전달을 시켰다. 또한 혈소판 내의 장기적인 형광 단백질의 발현을 확인함으로써 부유세포로의 성공적인 유전자 전달능력을 보였다. 본 연구는 기존 세포치료제들이 단핵구(monocyte)와 같은 부유세포에서 잘 작동하지 못하는 것과 달리, 생분해성 황화기를 포함한 LNPs는 그 한계를 극복하여 다양한 치료제로 개발될 수 있는 가능성을 입증하였다는 의의가 있다.