Pharmacokinetics and Toxicity of Heat Shock Protein 27 Inhibitor HSP-49 in Two Different Formulations

Abstract

HSP-49 is a heat shock protein (HSP) 27 inhibitor candidate which is developed to reduce resistance to anticancer drugs. In the present study, we performed the validation of the analytical method for HSP-49 detection in rat plasma. Two different formulations of HSP-49 (DMAc formulation and emulsion) were compared in terms of their pharmacokinetics and toxicity following intravenous injection. Single- and multiple-dose toxicity tests were performed in ICR mice via caudal vein injection of the HSP-49 formulations at four different doses; vehicle and control groups of mice were also included in the study. HSP-49 and HSP-27 (internal standard, IS) were extracted from plasma using acetonitrile. The HSP-49 and IS were found to elute at 22.9 min and 19.7 min, respectively, from rat plasma, without intrusive peaks from the endogenous compositions. The concentration range from 0.025 to 10 µg/mL had linear at the calibration curve. All the values of intra- and inter-day accuracy and precision were satisfactory and within acceptable limits. The AUC and t1/2 values of HSP-49 in the DMAc formulation were greater than those in the emulsion at two doses. However, the emulsion was less toxic than that in the DMAc formulation. In addition, the solubility of HSP-49 in the emulsion was 2-fold higher than DMAc formulation. In conclusion, the pharmacokinetic profile, toxicity, and solubility of HSP-49 differed between the DMAc formulation and the emulsion. Although increased body exposure and elimination half-life of HSP-49 were found in DMAc formulation, high solubility and safety of the compound were confirmed in the emulsion which is an acceptable formulation for clinical application.;HSP-49는 항암 내성유발을 억제하기 위한 열 충격단백질 27 (HSP 27) 저해제 후보 물질로 개발되었으며, 본 연구에서는 쥐의 혈장에서 HSP-49를 검출하기 위하여 HPLC 분석법을 확립 및 검증하였으며, HSP-49의 두 가지 제형을 제조하여 정맥 투여하였을 때 체내 동태에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보고자 하였다. 또한, 이 물질을 꼬리 정맥으로 단회 및 반복 투여하여 LD50을 구하고 어떤 독성이 나타나는지를 확인하고자 하였다. 쥐의 혈장에서 HSP-49를 정량하기 위해 혈장 중 HSP-49와 내부표준물질인 HSP-27을 순서대로 첨가한 뒤 아세토니트릴을 이용하여 한번에 추출하였다. 혈장 중 약물농도 분석을 위해 Shiseido Capcell-pak C18 MG120 컬럼 (3.0 x 250 mm, 5 μm)을 사용하였으며, 0.5 mL/min의 유속으로 이동상인 아세토니트릴 (0.1% TFA)-물 (0.1% TFA) (50:50, v/v)을 HPLC로 흘려주었다. HSP-49와 내부표준물질의 유지시간은 각각 22.9분 및 19.7분이었으며, 이 분석조건에서 HSP-49와 내부표준 물질은 기타 혈장 성분들과 잘 분리되었다. HSP-49의 검량선은 0.025-10.0 µg/mL의 농도 범위에서 양호한 직선성을 나타내었으며, 정량한계를 포함한 농도 (0.025 µg/mL)에서 일내 및 일간 정밀성은 6.1% 및 11.2% 이하이었고, 정확성은 93.8-106.5%를 나타내어 본 분석법이 혈장 중 HSP-49를 검출하는데 충분한 감도, 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 보여주었다. 이 분석법은 FDA에서 제시하는 생체시료 분석법 밸리데이션 가이드라인을 따랐으며, 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성 및 감도 측면에서 기준에 적합함이 검증되었다. 이와 같이 검증된 HPLC-UV 분석법은 동물실험 후 얻은 혈장 샘플을 분석하여 HSP-49의 농도를 검출하는데 적용되었다. 혈장 중 HSP-49는 실온과 37℃에서 각각 6시간, 4시간 동안 안정했고, 전처리 후 안정성을 비롯하여 세 차례에 걸친 냉∙해동 및 4주간의 장기보관 후에도 모두 안정함을 보여주었다. DMAc, Tween® 80, 생리식염수를 이용하여 DMAc 제형으로 만든 HSP-49를 정맥으로 투여한 결과, 2 mg/kg와 10 mg/kg에서 약물동태학적으로 직선성을 나타내었다. 또한, 약물에 대한 독성을 확인하기 위하여 꼬리 정맥으로 1회 투여한 결과, 고농도인 30 mg/kg에서 4마리 중 1마리가 사망하였으며 중간 농도인 15 mg/kg와 7.5 mg/kg에서 각 4마리 중 2마리씩 피부 괴사가 일어나는 것을 확인하였고, 따라서 LD50는 30 mg/kg 이상임을 확인하였다. 이러한 독성을 완화시키고 용해도를 개선하고자 유액 제형을 제조하였다. 유액 제형은 계면활성제와 보조 계면활성제를 함유한 O/W 제형으로 DMAc 제형에 비해 용해도가 개선되었음을 확인하였다. 또한, 유액 제형의 내상은 3.55 µm의 입자크기로 균일하게 수상에 분산되어 있어 안정한 상태임을 보여주었다. 유액 제형화한 HSP-49를 꼬리 정맥으로 1회 및 반복 투여하였을 때 독성은 관찰되지 않았고 LD50은 50 mg/kg 이상인 것으로 확인하였다. 반면에 약물동태학적 측면에서는 DMAc 제형이 혈장 중 농도(C0), 소실반감기 (t1/2) 및 혈장 중 농도-시간 곡선 하 면적 (AUClast)이 유액 제형에 비해 현저히 증가하였고, 이는 약물의 체내 소실과 관련된 클리어런스가 감소하였기 때문으로 보인다. 반면, 유액 제형에서는 봉입된 약물이 빨리 소실됨으로써 약물의 체내 노출이 감소하였으나 제형에 사용된 여러 성분들은 인체에 사용이 가능했으므로 독성은 감소한 것으로 보인다. 결론적으로 본 연구에서는 HSP-49의 간단한 HPLC-UV 분석법을 확립 및 검증하였고, 제형에 따라 HSP-49의 체내 동태와 독성이 서로 다른 양상을 나타냄을 확인하였다. 또한 용해도가 개선된 제형을 모색하고 인체 적용 가능성을 검토하였다는 점에서 의의가 있다 하겠다.