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The effect of lipid nanoparticle mediated GTSE1 gene silencing in liver fibrosis mouse model

Title
The effect of lipid nanoparticle mediated GTSE1 gene silencing in liver fibrosis mouse model
Authors
신수민
Issue Date
2024
Department/Major
대학원 약학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
서원효
Abstract
Lipid nanoparticles (LNPs) are increasingly employed in the treatment of liver diseases, neurological diseases, and autoimmune diseases, serving a highly efficacious drug delivery system. As a delivery platform for RNA therapeutics, LNPs have received tremendous attention for delivering RNAs to target cells. Liver fibrosis is a chronic and irreversible liver disease, currently lacking sufficient effective therapeutic approaches. Despite its clinical significance, effective therapeutic options are limited. In a previous study, it was demonstrated that LNPs encapsulating siGTSE1 were employed in the treatment of pulmonary fibrosis. The GTSE1 is also highly associated with the progression of HCCs. Based on this evidence, we focused on investigating the roles of LNPs-siGTSE1 in carbon tetrachloride-induced liver fibrosis model and evaluated the underlying mechanisms. LNPs encapsulating siGTSE1 were administered via IV injection to CCl4-induced liver fibrosis mouse model. The serum and liver tissues were evaluated for the effects of LNPs-siGTSE1. Extracellular vesicles were isolated from the blood serum and EV-miRNA was analyzed. LNPs efficiently delivered GTSE1 siRNA, leading to the downregulation of GTSE1 expression and subsequent alleviation of liver fibrosis. It has been recognized that the expression of Hepatocyte Nuclear Factor 4 Alpha (HNF4α) is a crucial regulator of hepatic cell function. The number of EVs was lower in the serum from LNPs-siGTSE1 treated mouse. In addition, miR-192-5p (an important miRNA associated with the progression of liver fibrosis) was downregulated in the siGTSE1 treated mouse group. The transfection and overexpression of miR-192-5p in LX-2 cells led to a pronounced exacerbation of fibrotic manifestations. Our data manifested that GTSE1 KD leads to increased expression of HNF4α and concurrent downregulation of miR-192-5p. Therefore, our study has focused on the association between LNP-GTSE1 and HNF4α in CCl4-mediated liver fibrosis. Our study highlights the promise of LNPs as a therapeutic platform for liver fibrosis, utilizing siRNA delivery to target GTSE1. This finding will serve the potential of LNPs as a novel treatment strategy for liver fibrosis. Furthermore, further research is warranted, as it has been established that GTSE1 exerts an influence on liver function through its interaction with HNF4α and miR-192-5p.;짧은 간섭 RNA (siRNA)는 단순히 하류 신호 전달 경로를 차단하거나 증상을 해결하는 것이 아니라 근본적인 원인을 표적으로 삼아 수많은 질병을 치료할 수 있는 잠재력이 있다. 최근 암, 바이러스 감염, 염증성 신경 질환 및 유전 질환을 포함한 까다로운 질병의 치료를 위해 수많은 siRNA 캡슐화 LNP가 보고됐다. 섬유증이 진행되면 간경변증으로 발전하거나 궁극적으로 돌이킬 수 없는 암으로 발전할 가능성이 있으므로 진단과 치료는 초기 단계에서 우선시해야 한다. 따라서, LNP의 활용을 통해 간 섬유증의 개선을 촉진하기 위한 연구가 절실히 요구되고 있다. LNP는 일반적으로 ionizable lipid, cholesterol, phospholipid, 그리고 PEG-lipid로 구성된다. 우리는 LNP의 중요한 구성 요소인 ionizable lipid의 아민 코어와 링커 길이를 최적화해 LNP 제제화를 했다. 이어서, 우리는 간 질환 치료를 위해 ionizable lipid (244cis)를 포함하는 최종 LNP의 잠재적인 치료 효능에 대한 조사를 수행했다. CCl4는 주로 산화 스트레스 및 염증과 관련된 메커니즘을 유발하여 간세포 손상을 유도하는 간 독성 물질로 대표적인 간 섬유화 모델로 사용된다. 대조적으로, BDL 모델은 담즙 흐름의 장애로써 문맥 섬유증을 동반하고 급성 폐쇄성 황달을 유발하는 간 섬유화 모델이다. CCl4 유발 간 섬유증 모델과 BDL 간 섬유증 모델에서 관찰된 GTSE1의 발현의 차이는 이 두 실험 모델이 서로 다른 병리학적 과정을 기인하고 있기 때문이라고 볼 수 있다. 우리의 관찰에 따르면 LNP를 통한 GTSE1의 억제가 간 섬유증의 개선을 초래한다는 것을 확인했다. DNA 손상, 세포 사멸, 산화 스트레스에 대한 조사를 했다. GTSE1은 p53 유도성 유전자이며, p53의 과발현은 세포질로의 전위를 촉진하여 다양한 암에서 세포 증식, 이동 및 침입을 촉진하는 데 관여한다. GTSE1은 p53의 안정성과 기능성을 조절하여 DNA 손상으로 인한 세포사멸을 조절하는 것으로 보인다. 이전 연구에서 GTSE1의 하향 조절이 HCC 세포의 증식, 이동 및 침입을 방해하는 동시에 세포사멸 경로를 유도한다는 증거를 제공했다. 암과 섬유증의 메커니즘 차이가 있지만, 간 섬유화에서 DNA 손상, 세포 사멸 및 산화 스트레스를 조절하는 GTSE1의 역할을 제시했다. 이전 연구에서 간경변증 모델에서 HNF4α mRNA LNP가 간경변증을 완화시키는 것을 확인했다. 우리의 결과는 GTSE1 수준의 감소가 HNF4α 발현을 상향 조절함으로써 간 섬유증을 개선시키는 것을 보여줬다. HNF4α는 간 항상성의 중심 조절자로 기능하며, 간세포 분화를 유지하고 증식을 억제함으로써 세포 과정을 보존하는 데 중추적인 역할을 한다. 세포 주기 조절에서 GTSE1의 역할과 간세포에서 HNF4α의 발현을 고려할 때 GTSE1과 HNF4α가 상호작용하여 잠재적으로 간 기능 향상에 기여할 수 있다는 가설을 세울 수 있다. 따라서, GTSE1과 HNF4α 사이의 잠재적 연관성을 조사하기 위한 추가 연구가 필요하다. 이전 연구에서 간 손상이 일어나면 EV가 증가하는 것을 확인했다. 세포 손상이 발생하면 다양한 유해 신호 분자가 생성되며 EV는 염증 유발 신호를 방출하고 세포 간 상호작용을 통해 이웃 세포에 손상을 일으킨다. siGTSE1 High 그룹에서 EV 수준의 감소를 보여주는 우리의 연구 결과는 간 손상의 개선을 시사한다. 결과에서 확인된 17개의 miRNA 중 간 섬유증과의 관련성을 확인하기 위해 이전 연구 결과와 비교 분석을 통해 일치하는 miRNA를 분류했다. 따라서 17개 miRNA 중에서 우리는 HNF4α와의 연관성이 있는 것으로 알려진 miR-192-5p를 분석하기로 했다. miR-192-5p는 간 조직 내에 특히 풍부하다. miR-192-5p의 발현은 형질전환 성장 인자 β1 (TGF β1)과 HNF4α에 의해 조절된다. 이전 연구에서 NAFLD 진단을 받은 환자에서 얻은 EV에 miR-192 수준이 상향 조절된 것을 확인했다. 따라서 우리는 LX-2 세포에서 miR-192-5p를 형질감염시켜 과발현을 유도했을 때 섬유증이 악화되는 것을 확인했다. 우리 연구결과에 따르면 CCl4에 의해 유발된 간세포 손상은 EV 생산 증가로 이어지며, 특히 miR-192-5p의 조절을 통해 간 성상 세포(HSC)에 영향을 미쳐 간 손상에 기여한다. 결과적으로, siGTSE1 LNP는 EV 생산을 감소시켜 간 성상 세포에 대한 영향을 완화하고 궁극적으로 간 기능을 개선한다. miR-192-5p는 EV에서 세포 외 공간으로 방출되므로 GTSE1 및 HNF4α의 발현을 조절하여 간 기능을 조절할 수 있다. 본 연구에서는 siGTSE1이 캡슐화된 LNP가 간 섬유증을 개선한다는 증거를 제공하여 간 섬유증의 새로운 치료 전략으로서의 가능성을 강조했다. 또한 GTSE1이 HNF4α 및 miR-192-5p와의 상호 작용을 통해 간 기능에 영향을 미치는 것을 입증하는 추가 연구가 필요하다.
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