Discovery of potent A2aAR antagonists to target HSC for use in NASH

Abstract

비알코올성 지방간질환은 간 내 단순 지방증부터 비알콜성 지방간염 및 간섬유화를 이르는 일련의 질환을 의미한다. 간섬유화 및 간경변은 비가역적인 질병으로 회복이 어렵고, 사망률이 매우 증가하기 때문에 만성 간질환의 조기 발견 및 치료가 매우 중요하다. 지방간염은 간세포를 파괴하고, 이때 분비되는 각종 사이토카인은 간성상세포를 활성화시켜 콜라겐과 같은 세포외 기질 및 α-SMA의 생성 및 축적을 야기한다. 염증성 세포는 아데노신 삼인산(ATP)를 과도하게 분비한다. 아데노신 삼인산은 아데노신 대사를 통해 세포 외 아데노신으로 전환되어, 아데노신 수용체를 통해 다양한 세포 내 신호전달을 매개한다. 아데노신 수용체는 G 단백질 결합 수용체로써 Gi 단백질과 결합된 아데노신 1 수용체와 아데노신 3 수용체, 혹은 Gs 단백질과 결합된 아데노신 2a 수용체와 아데노신 2b 수용체가 존재한다. 그 중 아데노신 2a 수용체가 염증 반응에 관여한다는 이전 연구를 기반으로, 아데노신 2a 수용체와 간성상세포의 상관성을 파악하기 위해 public database를 이용하였다. 그 결과, 아데노신 2a 수용체는 비활성화 상태의 간성상세포에서 4 종류의 수용체 중 발현이 가장 높았으며, 간성상세포의 활성화에 따라 그 발현량이 크게 증가함을 확인했다. 아데노신 2a 수용체와 간질환의 연관성을 동물 모델에서 확인하기 위해 Choline deficient-high fat diet를 6주간 급여하여 마우스 비알콜성 지방간 모델을 구축하였다. 비알콜성 지방간이 생성됨에 따라 아데노신 2a 수용체의 발현량이 크게 증가함을 확인하였다. 간성상세포와 아데노신 2a 수용체의 관계를 면밀히 파악하기 위해, 인간 간성상세포주인 LX-2에서 실험을 진행하였다. 간성상세포의 활성화를 유도하는 사이토카인인 TGF-β1을 처리하여 활성화시킨 LX-2 세포에서 이전 public database를 이용한 결과와 동일하게, 아데노신 2a 수용체의 발현량이 급격히 증가하였다. 또한, 아데노신 2a 수용체를 과발현시킨 LX-2 세포에서도 collagen과 α-SMA의 발현량이 증가하였다. 이는 비알코올성 간질환 동물 모델에서 아데노신 2a의 수용체가 발현이 높아진 이유로 보상기전을 배제하며, 아데노신 2a 수용체가 질병을 악화시킬 수 있다는 것을 암시한다. 아데노신 2a 수용체의 리간드 중 간성상세포의 아데노신 2a 수용체에 작용하여 항염, 항섬유화 효과를 유도하는 것을 찾기 위해, 아데노신 2a 수용체 선택적 길항제인 ZM241385와 작용제인 CGS21680을 TGF-β1으로 활성화시킨 LX-2 세포에 각각 처리하였다. 길항제인 ZM241385는 우수한 항섬유화 효과를 나타낸 반면, 작용제인 CGS21690을 처리한 경우 섬유화 증상이 악화되었다. 아데노신 2a 수용체를 과발현시킨 경우에서도 이와 동일한 결과가 나타났다. 이전 연구에서 아데노신 2a 수용체의 길항제가 간성상세포에서 항섬유화 효과를 보였기 때문에, 아데닌 유도체로 합성되어진 10개의 화합물 중 아데노신 2a 수용체의 길항제로 작용하는 화합물을 찾기 위한 스크리닝을 실시하였다. 스크리닝은 아데노신 수용체의 대표적인 하위 신호전달체계인 AC/cAMP/PKA/CREB의 변화 정도를 확인하기 위해 CRE promoter activity와 섬유화 및 간성상세포의 마커의 감소 정도를 확인하며 진행하였다. 스크리닝 결과 화합물 1번과 10번의 항섬유화 효과가 가장 뛰어남을 확인하였다. 선별된 두 개의 화합물은 활성화된 간성상세포의 증식을 유의적으로 억제시켰고, in silico 도킹 포즈 예측을 통해 아데노신 2a 수용체의 길항 작용 잔기와 상호작용함을 확인하였다.;Activation of hepatic stellate cells (HSC) plays a crucial role in exacerbating non-alcoholic liver disease since activated HSC initiates and maintains fibrogenic process, especially progression of non-alcoholic steatohepatitis (NASH), which has no approved therapeutics yet. It has also been well reported that inflammatory cells promote excessive extracellular adenosine. These extracellular adenosine signals through adenosine receptors, which are a G protein-coupled receptor family. Thus, I have focused on adenosine receptors in HSC as a therapy strategy for NASH and liver fibrosis. In this study, I showed that overexpression of A2aAR induced pro-fibrogenic effects in human hepatic stellate cell line, LX-2. I also demonstrated that A2aAR antagonists had anti-fibrogenic effects, with decreased A2aAR protein expression level both in activated LX-2 cells by TGF-β1 and A2aAR-overexpression. Based on the previous results, I evaluated anti-fibrogenic effects of a series of 10 compounds synthesized as adenine derivates using CRE promoter activity and protein expression levels of fibrosis and HSC activation markers in vitro assay system. Among them, compounds 1 and 10 showed potent anti-fibrogenic activity. I further studied the proliferation inhibitory effects of compounds 1 and 10 and predicted their docking poses and interactions with A2aAR. As expected, compounds 1 and 10 inhibited proliferation in activated LX-2 cells by TGF-β1. Compounds 1 and 10 exhibited interactions with antagonism-related residues of A2AaR in in silico study. In conclusion, my observations provided a clue for A2aAR as a fibrosis inducible protein. Also, I demonstrated A2aAR specific antagonists had anti-fibrosis effects. I constructed in vitro screening system to evaluate a series of newly synthesized compounds. As a result, selected compounds 1 and 10 via constructed in vitro screening system, showed similar or better anti-fibrogenic effects to ZM241385 in hepatic stellate cells.