Anti-inflammatory and neuroprotective effects of papaverine in neuroinflammatory disease models

Abstract

Papaverine (PAP) is an opium alkaloid used as a vasodilator agent. It exhibits its effect by inhibiting phosphodiesterase enzyme resulting in elevation of cAMP levels. It is also known for a selective phosphodiesterase inhibitor for PDE10A subtype mainly existing in the striatum of the brain. Phosphodiesterase inhibitors are known to have an anti-inflammatory effect in CNS. However, only few studies are reported for anti-inflammatory effect of papaverine. In the present study, I demonstrated the anti-inflammatory and neuroprotective effect of papaverine in vivo and in vitro system with detailed molecular mechanisms. In the first part of this study, I reported the effect of papaverine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory responses in microglial cells. Papaverine inhibited the expression of iNOS, proinflammatory cytokines, and matrix metalloproteinases (MMPs), and upregulated anti-inflammatory cytokine IL-10, in LPS-stimulated BV2 cells. Papaverine also suppressed LPS-induced enzymatic activities of MMPs. The anti-inflammatory effect of papaverine was confirmed in rat primary microglia and astrocytes. Detailed mechanistic studies revealed that papaverine exerts anti-inflammatory effects through inhibiting phosphorylation of MAP kinases, Akt phosphorylation, and NF-κB/AP-1 activity. Also, reactive oxygen species (ROS) production was decreased via suppression of p47phox expression by papaverine. Moreover, papaverine enhanced protein kinase A pathway by increasing intracellular cAMP levels, CREB phosphorylation and nuclear protein binding to CRE in addition to increased transcriptional activity of CRE-luc by papaverine. To determine whether PKA signaling pathway is important on anti-inflammatory effect of papaverine, BV2 cell is treated with H89, PKA inhibitor. Data showed the reverse effect of H89 on papaverine-mediated anti-inflammation. Transcriptional activities of ARE and PPRE induced by papaverine are also reversed by H89 suggesting important role of PKA pathway. In the second part of the study, I demonstrated the anti-inflammatory and neuroprotective effect of papaverine in vivo experiments. First, the anti-inflammatory effects of papaverine were verified in the mouse brain of systemic inflammation induced by administration of LPS. LPS-induced CD11b-, Iba-1-positive activated microglia are decreased by papaverine in the cortex and hippocampus. Furthermore, LPS-induced mRNA expression of proinflammatory mediators including iNOS, proinflammatory cytokines, TLR 2, 4, and MMP -3, -8 were inhibited while anti-inflammatory cytokine IL-10 was increased by papaverine. Anti-inflammatory effect of papaverine was reversed by H89 in LPS-injected mice. Papaverine-mediated inhibition of microglial activation was reversed by H89. In addition, mRNA levels of proinflammatory cytokines were also reversed. Since prolonged neuroinflammation may cause neurodegeneration, I investigated MPTP-injected mice as an animal model of Parkinson’s disease (PD). The results show that MPTP-derived dopaminergic neuronal cell death and impaired locomotor activity were recovered by papaverine. In addition, papaverine suppressed microglial activation and proinflammatory mediators, while it increased IL-10 in MPTP-injected mice. Overall, papaverine with its strong anti-inflammatory and neuroprotective effect may be a potential candidate for treating neuroinflammatory disorders such as Parkinson’s disease.;파파베린은 아편에서 생성되는 알칼로이드 중 하나로, 근육이완제와혈관확장제로 쓰이는 물질이다. 이 물질은 포스포다이에스터라아제의 활성을 억제함으로써 세포 내 cAMP 농도를 높이는 역할을 한다. 또한, 뇌의 선조체에 많이 존재하는 포스포다이에스터라아제 10A 에 특이적인 억제제로 알려져 있다. 포스포다이에스터라아제의 억제제는 중추신경계에서 항염증의 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 파파베린의 항염증 효과에 대한 연구는 아직까지 부족한 상태이다. 본 연구에서는 in vitro 와 in vivo 실험을 통해 파파베린의 항염증 및 신경보호 역할 및 그에 따른 기전을 확인 해 보았다. 첫번째로 LPS로 유도되어 활성화 된 소교세포에서 파파베린의 항염증 효과를 확인해 보았다. 파파베린은 LPS에 의해 유도된 iNOS, MMPs 그리고 염증성 사이토카인의 발현을 억제하였고, 항염증 사이토카인인 IL-10은 증가시켰다. 또한 파파베린은 MMPs 효소의 활성도 감소시켰다. 이러한 파파베린의 항염증 효과는 1차 소교세포와 성상세포에서도 확인되었다. 파파베린에 의한 항염증 기전 연구를 수행한 결과 LPS에 의한 MAP kinases 와 Akt의 인산화, 그리고 NF-κB/AP-1의 활성이 파파베린에 의해 감소하는 것을 확인하였고, 파파베린이 p47phox의 발현을 억제하여 활성산소 (ROS)의 생성을 감소시켰다. 파파베린은 cAMP의 세포 내 농도를 증가시켜 PKA 의 신호전달을 유도하였는데, 이는 CREB의 인산화와 핵 내 단백질과 CRE의 DNA 결합 및 전사활동을 증가시켜 소교세포의 활성화가 억제됨을 확인하였다. PKA의 신호전달이 파파베린의 항염증에 중요한 역할을 하는지에 대해 확인하기 위해 PKA의 억제제인 H89 를 처리하여 실험을 진행하였다. H89는 파파베린의 항염증 효과를 억제하였고, 특히 파파베린에 의해 유도된 ARE 와 PPRE 의 전사활동의 증가가 H89 에 의해 감소되는 것을 확인함으로써 PKA 신호전달의 중요성을 확인할 수 있었다. 두번째로 파파베린의 항염증 및 신경보호 역할을 in vivo 실험을 통해 확인하였다. 먼저, LPS를 투여하여 유도된 전신염증 마우스의 뇌에서 파파베린에 의한 항염증 효과가 확인되었다. 쥐의 대뇌 피질과 해마에서 활성화 된 소교세포가 파파베린에 의해 감소하는 것을 CD11b와 Iba-1 염색을 통해 확인할 수 있었다. 또한 파파베린은 염증성 매개인자인 iNOS, TLR 2, 4, MMP-3, -8, 그리고 염증성 사이토카인의 발현은 감소시키고, 항염증 사이토카인인 IL-10은 증가시켰다. PKA 억제제인 H89 는 파파베린의 이러한 항염증 효과를 억제하였다. 장기적으로 지속되는 신경염증은 신경퇴화를 야기하므로, 퇴행성 신경염증 질환인 파킨슨병 (PD)의 동물모델을 이용하여 실험하였다. 파킨슨병의 동물모델을 만들기 위해 쥐에 MPTP를 투여하여 실험을 진행하였다. MPTP에 의해 유도된 도파민 뉴런의 사멸과 행동학적 운동장애가 파파베린에 의해 회복되는 것을 확인하였고, 이 모델에서 파파베린은 소교세포의 활성과 염증성 매개인자들을 억제하고, 항염증 사이토카인인 IL-10을 증가시켰다. 따라서 파파베린의 항염증 및 신경보호 효과는 파킨슨병과 같은 신경염증 질환의 치료 전략이 될 것으로 기대된다.