Actinobacillus succinogenes의 아스파르트산 수송단백질 Asuc_0142 기능 규명

Abstract

아스파르트산(Asp)은 탄소 4개, 음전하성, 비필수아미노산으로 단백질의 building block으로 사용되는 것 외에도 7가지 아미노산 (알라닌, 아스파라긴, 메티오닌, 라이신, 트레오닌, 아이소류신, 글루탐산) 합성, 요소회로, 뉴클레오티드 합성의 전구물질 또는 중간물질로 사용된다. A. succinogenes의 서식지인 소의 반추위 아미노산을 성분 분석한 결과, 아스파르트산은 전체 아미노산 조성의 16% (13mg/l)를 차지하는데, 이 수치는 글루탐산(32%, 26mg/l)에 이어 2번째 높은 값이다. 또한 Rhie(2018)의 A. succinogenes transcriptome와 0142 유전자 스크리닝으로 Asuc_0142를 Asp 수송체 후보군으로 선정하고, 특성을 확인하였다. 대장균에서 Asuc_0142의 14C-Asp 흡수 수송활성은 Vmax는 11.7 U/gDW이고, Km은 72.6 μM였다. Exchange assay 결과, Asuc_0142는 양방향 C4-dicarboxylate(C4DC) 수송체로 확인하였다. 또한 A. succinogenes 야생형과 LMB070(△0142)에서 14C-Asp 흡수수송을 통해 Asuc_0142의 14C-Asp 수송활성을 확인하였다. A. succinogenes는 NH3, Gln이 존재할 때, Asp 수송이 감소했다. 그리고 NH3, 글루타민(Gln), Asp 중에서 A. succinogenes는 NH3를 가장 질소원으로 선호하는 것을 확인했다. 그러나 real-time PCR 결과, 질소원에 따른 Asuc_0142 발현은 일정하였다. pH 6 배지에서 A. succinogenes는 Asp 첨가에 따라 성장이 증가한다. 이 양상은 산성 생장에 기여한다고 알려진 아미노산 Gln, 라이신(Lys)과 같았다. A. succinogenes 야생형, LMB070(△0142)의 pH 6과 pH 7에서 Asp 흡수수송 활성을 측정했을 때 두 균주 모두에서 pH 6에서 활성이 감소했다. 두 균주의 real-time PCR 결과, pH 7과 pH 6에서 유전자 asuc_0140, asuc_0141, asuc_0142의 발현은 일정하였다. 정리하면, Asuc_0142 수송활성으로 수송단백질의 활성을 규명하였다. 그리고 질소원 및 pH에 따른 Asuc_0142의 발현량은 일정하였다.;Aspartate (Asp) is C4 dicarboxylic acid (C4DC), nonessential amino acid and used as building block, precursor of amino acids (alanine, asparagine, methionine, lysine, threonine, isoleucine, glutamate), urea cycle, synthesis of nucleotides. Through analysis of Rumen Fluid, the habitat of Actinobacillus succinogenes 130Z(A. succinogenes), Asp consists 16% of total amino acids. It means Asp is top 2 amino acid of rumen fluid, following glutamate (32%). By transcriptome of A. succinogenes (Rhie et al., 2018) and screening of 0142 gene, Asuc_0142 is determined as candidate of Asp transporter and characterized. In Escherichia coli (E. coli), 14C-Asp uptake activity of Asuc_0142 was confirmed that Vmax was 11.7 U/gDW and Km was 72.6 μM. By result of exchange assay, Asuc_0142 was determined as bi-directional C4DC transporter. Through 14C-Asp uptake assay in A. succinogenes 130Z, Asp uptake activity of Asuc_0142 was confirmed. In existence of NH3 or glutamine (Gln), A. succinogenes decreased uptake of Asp. A. succinogenes prefered NH3 as nitrogen source among NH3, Gln, Asp. Gene expression of Asuc_0142 showed no difference following nitrogen source (NH3, Gln, Asp). Growth of A. succinogenes increased with the addition of Asp in pH 6. It was similar with Gln, Lysine, known as contribution in acidic survival. However, A. succinogenes wild type and LMB070(△0142) showed that 14C-Asp uptake of pH 6 was lower than 14C-Asp uptake of pH 7. Through real-time PCR, there is no significant change in gene expression of pH 6, compared to pH 7. As a result, Asuc_0142 activity was characterized by transport assay. Also, Asuc_0142 showed constant level of gene expression, regardless of pH or nitrogen source.