Effects of an estrogen receptor β agonist on diurnal patterns of clock proteins in the normal and ischemic brain of aged female mice

Abstract

Background and Objectives: Circadian rhythms include all biological oscillations that follow a 24-hour cycle in organisms. The circadian rhythms maintain biological homeostasis, which regulates cycles of sleep and wakefulness, hormone secretion, and blood pressure; dysregulated rhythms are associated with various age-related diseases such as metabolic syndrome, cancer, and neurodegenerative disorders. At the cellular level, the circadian rhythm is controlled by clock proteins consisting of Clock/Bmal1 and their negative feedback produced by PER/CRY. Clock proteins are involved in inflammatory responses but the changes in the expressions of clock proteins in aged tissues that accompany mild inflammation are not clearly defined. In particular, although the transcription of estrogen receptor β (ERβ) is directly modulated by clock proteins, the interaction between ERβ and clock proteins in the brain of estrogen-deficient aged female mice has not been reported. To define whether diurnal expressions of clock proteins change with aging, expressions of clock proteins depending on day and night times were examined in the liver, visceral adipose tissue, and brain of aged female mice. In addition, the neuroprotective effects of diarylprepionitrile (DPN), an ERβ agonist, were determined in the ischemic brain of aged female mice to define its effects association with regulation in the expressions of clock proteins. Materials and Methods: Young (2.5-month-old) and aged (20-month-old) female mice (C57BL/6) were used. The livers, visceral adipose tissues, and brains of mice were collected at day (10 AM) and night (10 PM) with 12-hour intervals. Aged female mice were randomly divided into vehicle (0.1 ml sesame oil) or DPN (0.8 mg/kg)-treated groups, and each drug was administered subcutaneously for six days. In another set of experiments for ischemic stroke, each drug was administered starting 3–6 days prior to transient middle cerebral artery occlusion (MCAO). In the ischemic stroke group, ipsilateral hemispheres were collected at 12-hour intervals for three days after reperfusion. The expression levels of clock proteins (Clock, Bmal1, PER1/2, CRY1/2, and Rev-erb α) and proinflammatory cytokines (IL-1β and TNF-α) were measured by western blot. Behavioral tests (neurological score, wire-suspension test, cylinder test, and grip strength test) were performed before and at three days after MCAO, and infarct volume was measured at the end of experiments. Results: Compared to young female mice, Clock and Bmal1 expressions were increased, while PER1/2 and CRY1/2 levels were decreased at both day and night times in the livers, visceral adipose tissues, and brains of aged female mice. After DPN treatment, the changes in the expressions of Clock, Bmal1, PER1/2, CRY1/2, and Rev-erb α in the brains of aged female mice were restored to those levels of young female mice. Compared to the vehicle group, neurological deficits and infarct volumes were reduced in the DPN-treated aged female mice. Changes in diurnal patterns of all clock proteins were not observed in the ischemic brains of either young or aged female mice, but expressions of some of clock proteins and proinflammatory cytokines were changed on day 1 in aged female mice compared to young female mice; these changes were reduced by DPN. Conclusions: This study demonstrated that diurnal patterns in the expressions of clock proteins and proinflammatory cytokines in the brain and peripheral organs change with aging. These changes in the normal and ischemic brains of aged female mice were associated with ERβ activity. These results suggest that the regulation of ERβ activity can be an important target for the prevention and treatment of brain ageing and age-related brain diseases caused by changes in clock proteins’ expression.;연구 배경 및 목적: 일주기리듬이란 24시간 주기성을 갖는 모든 생체 리듬을 포괄한다. 생체 내 일주기리듬은 수면 및 각성, 호르몬 분비와 혈압 등의 생물학적 항상성을 유지하고, 이의 불균형은 대사증후군, 암과 퇴행성 신경 질환과 같은 다양한 노인성 질병 발생과 관련이 있다. 세포 수준에서, 일주기리듬은 시계 단백들인 Clock/Bmal1이 PER/CRY에 의한 음성적 되먹임에 의해 조절된다. 시계 단백들은 염증 반응과도 관련이 있는데, 경도의 염증이 동반되는 노화 조직에서의 일주기 시계 단백들의 변화는 알려진 바 없다. 특히, 에스트로겐 수용체 베타 (ERβ)는 시계 단백들에 의해 발현 조절되지만, 에스트로겐이 감소하는 여성의 노화 뇌에서 ERβ와 시계 단백들의 관련성은 보고된 바 없다. 본 연구에서는 노령의 암컷 마우스를 대상으로 낮과 밤의 간, 내장지방 및 뇌에서의 시계 단백들의 발현 변화를 확인하여 노화에 따른 시계 단백들의 일주기성 리듬 변화를 규명하고자 하였다. 또한 뇌 보호작용을 가진 ERβ 작용제인 diarylpropionitrile (DPN) 처치가 뇌허혈 손상 후 시계 단백들의 일주기성 발현 변화 조절에 관여하는지 연구하였다. 연구 방법: 젊은 성체(2.5개월) 및 노령(20개월) 암컷 마우스(C57BL/6)를 사용하였다. 마우스의 간, 내장지방 및 뇌 조직을 12시간 간격으로 낮(오전 10시)과 밤(오후 10시)에 수집하였다. 노령 암컷 마우스를 무작위로 대조군(0.1 ml sesame oil) 또는 DPN(0.8 mg/kg) 투여군으로 나누어 6일간 피하로 투여하였고, 이들을 대상으로 한 일부 실험은 허혈성 뇌졸중을 유도하기 위해 일시적인 중대뇌동맥폐색 3일 전부터 6일간 투여하였다. 허혈성 뇌졸중 군에서는 재관류 후 3일동안 12시간 간격으로 뇌 조직을 수집하였다. 시계 단백질(Clock, Bmal1, PER1/2, CRY1/2, Rev-erb α), 염증성 사이토카인 (IL-1β, TNF-α)의 발현량을 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 중대뇌동맥폐색 전과 3일 후 행동 실험(신경학적 점수, 와이어 서스펜션 테스트, 실린더 테스트 및 전지악력측정실험)을 수행하였고, 실험 종료 시 뇌경색 용적을 측정하였다. 연구 결과: 노령 암컷 마우스의 간, 내장지방 및 뇌 조직에서 젊은 성체에 비하여 시계 단백 Clock과 Bmal1은 높은 발현을 보이고, PER1/2와 CRY1/2는 낮은 발현을 보였다. 노령 개체의 뇌에서는 DPN 투여 시 시계 단백 Clock, Bmal1, PER1/2, CRY1/2, 그리고 Rev-erb α 발현의 변화가 젊은 성체 수준으로 회복되었다. 뇌허혈 손상 후, 대조군과 비교하여 DPN 투여군에서 신경학적 손상이 적었고 뇌경색 용적도 감소되었다. 허혈 뇌에서 모든 시계 단백들의 낮과 밤 패턴의 변화는 관찰되지 않았으나, 젊은 성체 대비 노령 개체에서는 1일째에 일부 시계 단백들과 염증성 사이토카인의 발현이 변화하였으며 이러한 변화는 DPN에 의해 감소되었다. 연구 결론: 본 연구에서는 노화에 따라 낮과 밤의 각 조직 내 시계단백질 및 염증성 사이토카인의 발현이 변화함을 확인하였다. 또한, 정상 및 뇌허혈 손상 후 낮과 밤의 뇌 내 시계단백질 및 염증성 사이토카인 발현 변화가 ERβ 활성과 관련이 있음을 관찰하였다. 이 결과들은 ERβ 활성 조절이 시계단백질 발현 변화에 의한 뇌 노화 및 노인성 뇌질환의 예방 및 치료에 중요한 타깃이 될 수 있음을 시사한다.