Enhanced Brain Delivery of Temozolomide by Dual Inhibition of P-glycoprotein and Breast Cancer Resistance Protein in Rats

Abstract

Glioblastoma (GBM) is one of the most common types of primary brain tumor. The GBM treatment is complex because the blood–brain barrier (BBB) plays a role as a physical barrier, and the efflux pumps such as P-glycoprotein (P-gp) or breast cancer resistance protein (BCRP) in BBB reduce the delivery of chemicals into the brain tissues from the systemic circulation. Temozolomide (TMZ), a small and highly lipophilic compound that can easily penetrate the brain, is used as a primary drug to increase the survival rate of GBM patients in clinical practice. Although TMZ is well known to penetrate the brain compared to other anticancer agents, the degree of TMZ delivery into the brain was insufficient, approximately 35% in rats and humans. Given that TMZ is figured as potential P-gp and BCRP substrate, the dual inhibition of both efflux pumps could be a promising approach to overcome the poor brain delivery of TMZ. Additionally, less effective dual inhibitors have been approved so far; developing a new dual inhibitor agent is necessary to improve agents’ delivery into the brain. In this study, we examined whether dual inhibition of P-gp and BCRP enhances the delivery of TMZ to the brain. Also, we tested several dual P-gp/BCRP dual inhibitor candidates in rat models to reveal their value as a therapeutic strategy to hinder P-gp and BCRP on BBB. In prior to animal tests, these candidates were selected in silico test and validated efficacy and toxicity tests in vitro tests in our laboratory. Elacridar, a widely used dual inhibitor of P-gp and BCRP, was used as a positive control. BX795, CGP60474, and Cdk 4/6 inhibitor Ⅳ were potential dual inhibitor candidates. All chemicals were administrated via intravenous (IV) route, concomitantly with TMZ at a dose of 10 mg/kg. To quantify TMZ in plasma and brain tissue, a high-performance liquid chromatography-ultraviolet (HPLC-UV) method was modified from the existing method to simplify sample preparation and to obtain high sensitivity. There were no meaningful differences in TMZ plasma concentration regardless of the presence of inhibitors, leading to no significant difference in most pharmacokinetic parameters. However, as expected, TMZ concentration in brain tissues and brain-to-plasma ratio were significantly increased following TMZ IV dosing concomitant with elacridar. With BX795 and CGP60474 treatment, the maximum ratio of brain to plasma was superiorly higher than that of TMZ alone at different time. (p < 0.05) On the other hand, in Cdk 4/6 inhibitor Ⅳ group, the TMZ concentration in brain tissues and brain-to-plasma ratios were slightly, but not significantly increased compared with TMZ alone. These results figure that co-administration of P-gp and BCRP dual inhibitors improves TMZ delivery to the brain without affecting plasma profiles. Also, BX795 and CGP60474 could be novel agents that suppress both P-gp and BCRP on BBB in rats at a dose of 10 mg/kg.;혈액-뇌 관문은 뇌에 있는 특이적인 구조로 빽빽하게 늘어선 혈관 내피 세포들과 강한 세포 연접을 특징으로 하며, P-당단백질이나 유방암 저항 단백질과 같은 다양한 배출 수송체들이 위치해 있다. 혈액-뇌 관문은 뇌 조직 내로의 외부 물질의 출입을 엄격히 제한하여 외부 물질로 인한 뇌 조직의 손상을 최소화하는 역할을 한다. 그러나 이러한 특징은 뇌종양과 같은 질병을 치료할 때 약물의 뇌 내 이행을 방해하는 요인으로 작용하므로 이를 극복하고자 하는 연구들이 진행되고 있다. 테모졸로마이드는 뇌종양 중 가장 흔하고, 예후가 좋지 않다고 알려져 있는 교모세포종의 1차 치료제이다. 최근 연구에서 테모졸로마이드가 P-당단백질과 유방암 저항 단백질의 잠재적 기질임이 밝혀졌다. 따라서 본 연구에서는 테모졸로마이드를 모델 약물로 선정하고, P-당단백질과 유방암 저항 단백질을 이중으로 저해하는 물질과의 병용 투여를 통해 뇌 내 이행률을 증진시키고자 하였다. P-당단밸질과 유방암 저항 단백질을 이중으로 저해하는 물질로 알려진 elacridar를 양성 대조군으로 사용하였고, in silico 상에서 이중 저해제로 아직까지 밝혀지지 않은 신규한 물질들을 선별하고, 세포 실험을 통해 독성 평가와 혈액-뇌 관문에서의 효능 평가를 마친 새로운 이중 억제 후보 물질인 BX795, CGP60474와 Cdk 4/6 억제제 Ⅳ와의 병용 투여를 통해 테모졸로마이드의 뇌 내 이행률의 증진할 수 있는지를 동물 모델에서 검증하였다. 테모졸로마이드의 뇌 내 이행률은 동 시간대의 뇌 내 테모졸로마이드 농도를 혈 중 테모졸로마이드 농도로 나눈 뇌-혈장 농도 비율을 이용하여 판단하였다. 혈장과 뇌 조직 내 테모졸로마이드의 농도는 샘플 준비과정을 간소화하고 감도를 높일 수 있도록 기존 방법을 변형시킨 HPLC-UV 분석법을 이용하여 분석하였다. 또한 이 변경된 분석법을 FDA 가이드라인에서 제시한 방식대로 검증하였고, 추후 동물 실험에서의 농도 분석에 사용하였다. 테모졸로마이드를 정맥으로 투여한 후 elacridar을 포함하여 이중 저해제 후보군을 처리한 군과 처리하지 않은 군을 비교하였을 때, 약동학적 파라미터에서 유의한 차이가 나타나지 않았다. 또한 테모졸로마이드를 단독으로 투여한 군에서, 뇌 내 이행률은 약 35 % 정도로 나타났다. Elacridar을 포함하여 이중 저해제 후보군을 동시에 투여한 경우 최대 뇌 내 이행률을 나타내는 시간대는 물질들마다 달랐으나, Cdk 4/6 억제제를 투여한 군 외에 모든 군에서 단독 투여군과 비교하였을 때 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 특히 CGP60474를 투여한 경우, 최대 뇌 내 이행률이 72.8 %로 양성 대조군과 비슷한 정도로 테모졸로마이드의 뇌 내 이행률이 증가시켰다. 결론적으로, 본 연구를 통해 P-당단백질과 유방암 저항 단백질 이중 저해제를 동시에 투여하면 테모졸로마이드의 혈중 프로파일을 변화시키지 않으면서 뇌로의 이행을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 새로운 이중 저해제 후보 물질인 BX795나 CGP60474가 쥐의 혈액-뇌 관문에 존재하는 P-당단백질과 유방암 저항 단백질을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.