Investigation of brightening effects of methyl anthranilate in murine and human melanoma cells, and 3D human skin model

Abstract

Methyl anthranilate, also known as MA, is an ester form of anthranilic acid. MA is a main fragrant ingredient of grapes, which is used as a flavoring agent. Here, we studied whether MA has hypopigmentation effects using murine melanoma cell, B16F10; human melanoma cell, MNT-1; human keratinocyte cell, HaCaT; and pigmented 3D human skin model, MelanodermTM. Alpha-melanocyte stimulating hormone (α‐MSH) was used to induce the pigmentation of cells. Arbutin, bisabolol, and kojic acid, well-known as whitening agents, were adopted as positive controls. Melanin assay was conducted with nontoxic concentrations of MA in B16F10 cells and MNT-1 cells for 72 h. MA treatment reduced the melanin contents of B16F10 cells and MNT-1 cells in a dose-dependent manner. In the co-culture of MNT-1 cells and HaCaT cells, a decrease in the elongation of dendrite in MNT-1 was observed. In the mechanism study, MA showed no significant inhibitory effect on both mushroom tyrosinase and cellular tyrosinase from lysates of B16F10 cells. The real-time polymerase chain reaction (PCR) assay showed that MA induced the mRNA downregulation of tyrosinase, tyrosinaserelated protein 1 (TRP-1) and tyrosinase-related protein 2 (TRP-2), which are involved in melanin production. Western blot analysis also confirmed a reduction of all three enzymes. Of these, TRP-1 and TRP-2 were more potently suppressed than tyrosinase by MA. Also, cyclic adenosine monophosphate (cAMP), the maturation signaling molecule, was significantly downregulated in B16F10 cells. The brightening effect of MA had been further confirmed in a pigmented human epidermal skin model, MelanodermTM. MA manifested a visible whitening effect which could be further confirmed in the image analysis for the decrease in the area and amount of melanin inside the tissue. In conclusion, we demonstrated that MA has sufficient skin-brightening effects for a new cosmetic active ingredient.;메틸 안트라닐레이트(Methyl anthranilate, MA)는 안트라닐산의 에스테르 형태이다. MA는 진한 포도의 향을 내는 주요 성분으로 주로 향료로 사용된다. 이번 실험에서 쥐의 흑색종 세포인 B16F10, 인간의 흑색종 세포인 MNT-1, 인간의 각질 세포인 HaCaT 그리고 3D로 만든 인간 피부 모델인 멜라노덤을 사용하여 MA가 색소 생성을 저하하는 효과가 있는지 연구하였다. 알파-멜라노사이트 자극 호르몬 (αMSH)을 이용해 세포의 색소 침착을 유도했다. 미백제로 알려진 알부틴, 비사볼롤, 코직산을 양성 대조군으로 사용하였다. 멜라닌 생성 저해 효과 분석은 저독성 농도의 MA를 B16F10 세포와 MNT-1 세포에 72시간 동안 처리하여 진행되었으며, MA는 B16F10 세포와 MNT-1 세포에서 용량 의존적으로 멜라닌 함량을 감소시켰다. MNT-1 세포와 HaCaT 세포의 공동배양에서는 MNT-1 덴드라이트의 신장이저해되는 효과가 관찰되었다. 메커니즘 연구에서 MA는 버섯 유래 티로시나아제와 B16F10 세포의 티로시나아제 모두에서 유의미한 억제 효과를 보이지 않았다. 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 분석은 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질 1 (TRP-1) 및 티로시나아제 관련 단백질 2 (TRP-2)를 mRNA 수준에서 감소시키는 효과를 보여주었다. 그리고 웨스턴 블롯 분석을 통해 해당 단백질들의 발현 감소도 확인하였다. 그러나 티로시나아제는 다른 효소들에 비해 효과적으로 감소하지 않았다. 우리는 또한 성숙을 유도하는 신호 분자인 고리형 아데노신 일인산 (cAMP)가 B16F10 세포에서 현저하게 감소한다는 것을 발견했다. MA의 미백 효과는 3D 인간 표피 피부 모델인 멜라노덤을 이용한 16일간의 실험에서 다시 한번 확인되었다. 육안으로 관찰되는 미백 효과뿐 아니라 다양한 염색 기법을 사용하여 조직 내부의 멜라닌 면적과 수가 감소하는 것도 확인되었다. 우리는 MA가 화장품 유효성분으로 새롭게 개발되기에 충분한 피부 미백 효과가 있음을 확인했다.