Construction of a New Human scFv Library with CDR-H3 Optimized by Machine Learning

Abstract

The in vitro antibody phage display technology is powerful method of rapidly isolating high-affinity and target specific antibody fragments. Since it is possible to obtain human antibodies against virtually any given antigens, it has a very high utility in the development of new therapeutic antibody candidates with low immunogenicity. The high quality and size of the library are important factors in the successful isolation of antibodies in vitro. Synthetic antibody libraries have the advantage of the greater control over the framework sequences, amino acid composition, codon usage, and complementarity-determining regions (CDRs) diversity; moreover, high levels of expression, high solubility and stability, and relatively simple engineering and optimization are hallmarks of well-designed synthetic antibody libraries. The quality of individual clones constituting the library, e.g. expression, stability, and immunogenicity are also factors that determine the performance of an antibody library. Although many techniques for designing CDR regions that mimic natural CDRs have been developed, random combinatorial synthetic CDRs inevitably contain non-natural sequences, and a significant portion of the clones may be non-functional or have unfavorable biophysical properties. To alleviate these problems, a synthetic antibody library, OPALS (Optimized Phage Antibody Library, Second generation) had previously been constructed by combining highly stable frameworks with predetermined, non-combinatorial CDR sequence diversities that mimic natural CDRs with somatic hypermutations but without undesirable post-translational modification (PTM) motifs. The constructed library was verified by next-generation sequencing (NGS) analysis, and it was confirmed that the library consists of clones with natural antibody-like CDR sequences and with the minimal occurrence of the undesirable PTM motifs. Antibody sequences with fast enrichment during biopanning were analyzed through an additional NGS analysis, and the OPALT (Optimized Phage Antibody Library, Third generation) was constructed using this information. Importantly, the graft design of CDR-H3 sequences was subjected to a machine learning analysis, and thousands of the CDR sequences predicted to be efficiently enriched by phage display were chosen for the library construction. Many antibody clones selected from OPALS showed nanomolar range of affinities for the target antigens, validating the design strategy of the library. For the majority of the antigens tested, the new synthetic antibody library OPALT produced better selection results than OPALS in terms of the number of target-binding clones and the sequence diversity of the selected binders. To summarize, highly functional antibody libraries OPALS and OPALT could be constructed using non-combinatorial synthetic CDR diversity, and the machine learning-based design strategy of OPALT to enhance the panning enrichment efficiency was successfully validated against a number of antigens. The findings from this study provide a novel strategy for the design and construction of high-quality antibody libraries suitable for challenging applications.;In vitro 항체 phage display 기술은 고친화도 및 표적 특이적 항체 단편을 신속하게 분리하는 강력한 방법이다. 임의의 항원에 대해 인간 항체를 수득 할 수 있기 때문에 인체의 immune response이 낮은 새로운 치료용 항체약물의 개발에 매우 유용하다. 높은 품질과 라이브러리 (library) 크기는 in vitro에서 항체를 성공적으로 생성하는데 중요한 요소가 되었다. 합성 항체 라이브러리는 프레임워크 (framework) 서열, 아미노산 조성, 코돈 (codon) 사용 및 CDR 다양성의 서열을 제어하는 장점이 있으며, 또한 높은 수준의 발현, 우수한 용해도 및 안정성, 간단한 엔지니어링 및 최적화는 잘 설계된 라이브러리의 특징이다. 라이브러리를 구성하는 개별 clone의 품질, 예) 발현, 안정성 및 면역 원성 또한 항체 라이브러리의 성능을 결정하는 인자이다. 천연 CDR을 모방하는 CDR 영역을 설계하기위한 많은 기술이 개발되었지만, 합성 CDR의 무작위 조합은 여전히 비 천연 서열을 함유하고 클론의 상당 부분은 비 기능적이거나 바람직하지 않은 생물물리학적 특성을 가질 수 있다. 이 문제를 완화하기 위해, 합성 항체라이브러리 (OPALS)는 체세포초돌연변이 (somatic hypermutation)를 갖지만 바람직하지 않은 번역 후 변형 (PTM) 모티프없이 자연 CDR을 모방하는 예정된 CDR 서열 다양성과 고도로 안정적인 프레임워크를 조합함으로써 구성되었다. 만들어진 라이브러리는 차세대 시퀀싱 (sequencing) 분석에 의해 확인되었고, 설계된 바와 같이, 천연 항체-유사 CDR 서열을 갖는 클론 및 바람직하지 않은 PTM 모티프의 발생을 최소화하는 클론으로 구성됨을 확인할 수 있었다. 바이오패닝 (biopanning) 동안 빠른 증폭을 갖는 항체 서열을 추가적인 차세대 염기서열 분석을 통해 분석하였고, 이 정보를 이용하여 OPALT (3세대 파지 항체 라이브러리)를 구축하였다. 중요하게는, CDR-H3 서열의 디자인은 기계학습 모델에 적용하여 파지 디스플레이에 의해 효율적으로 풍부해질 것으로 예상되는 수천 개의 CDR 서열을 라이브러리 구축을 위해 선택하였다. OPALS로부터 선택된 다수의 항체 클론은 표적항원에 대해 나노 몰 친화도를 보여주어 라이브러리의 설계 전략을 검증할 수 있다. 일부 항원에 대해서 새로운 합성 항체 라이브러리는 표적에 결합한 클론의 수 및 선택된 결합제의 서열 다양성 측면에서 OPALS보다 우수한 선택 결과를 보여주었다. 결과적으로, 비 조합 합성 CDR 다양성을 사용하여 기능성 항체 라이브러리를 성공적으로 구축할 수 있으며 바이오 패닝 동안 증폭 효율을 최적화하기 위한 기계학습 기반 설계 전략을 통해 많은 항원에 대해 새로운 합성 라이브러리 (OPALT)를 성공적으로 구축할 수 있었다. 우리의 연구결과는 라이브러리는 다양한 항원에 대한 인간 항체 생성에 유용할 것이며 치료용 항체 응용분야에 적합한 항체라이브러리 설계를 위한 새로운 전략을 안내한다.