Combinatorial Biosynthesis of Novel FK506 Derivatives with Antifungal Activity

Abstract

FK506 is a 23-membered macrocyclic polyketide isolated from Streptomyces tsukubanesis in 1984 and has been widely used as an immunosuppressant for the patient who gets an organ transplant surgery. However, the immunosuppressive activity serves as a limiting factor in its use of other therapeutic activities including antifungal, neuroregenerative, and neuroprotective activities. The main focus of the present study was to develop the novel FK506 derivatives via combinatorial biosynthesis approach and evaluate its biological activities for the establishment of a structure-activity relationship (SAR). Chapter I gives a brief overview of polyketide including immunosuppressant FK506. The Material and Methods section of Chapter II provides technical information to generate deletion mutants of biosynthetic genes and isolate the novel FK506 derivatives. In Chapter III, the four FK506 derivatives (9-deoxo-prolylFK506, 9-deoxoFK506, 31-O-demethylFK506, and 9-deoxo-31-O-demethylFK506) were isolated from Streptomyces sp. KCTC11604BP deletion mutants and evaluated their biological activities. These four FK506 derivatives have been identified in previous studies but have not examined the detailed biological activities before. The four FK506 derivatives were evaluated for its T-cell cytotoxicity, immunosuppressive activity, and antifungal activity. Compared with FK506, the four FK506 derivatives exhibited much higher inhibitory concentration 50 % (IC50) value to the cytotoxicity and immunosuppressive activity. And they showed that their antifungal activity was retaining against Cryptococcus neoformans, Candida albicans, and Aspergillus fumigatus, except for 9-deoxo-prolylFK506. Particularly, the 9-deoxo-31-O-demethylFK506 and 31-O-demethylFK506 displayed synergistic antifungal activity with fluconazole, like as FK506, even in vivo murine model. These change of activities along the modification at C9 and C31 provided a cornerstone as the preliminary SAR study. A wide range of chemical approaches has been conducted to develop FK506 derivatives with other therapeutic activities but with reduced immunosuppressive activity. However, the chemical substitution of FK506 at a specific position is very difficult because of its structural complexity. In Chapter IV, the novel FK506 derivatives containing altered C1, C9, C21, and C31 were biosynthesized by a series of deletion mutant strains from Streptomyces sp. KCTC11604P. The deletion mutants were constructed through the combinatorial biosynthetic engineering, including allyl side chain biosynthesis genes (TcsB and TcsD) and post-polyketide synthase (PKS) genes (FkbD and FkbM) based on previous studies. The modification at C1 and/or C9 was performed by deleting FkbD (cytochrome P450 hydroxylase), responsible for C9-oxidation, and whereas deletion of FkbM (methyltransferase) is used to generate 31-O-demethyl derivatives. In addition, the C21 side chain of FK506 was altered by in-frame deletion of β-keto-acyl synthase TcsB or dehydrogenase TcsD. The derivatives with methyl- and propyl- side chains were generated in ΔtcsB and ΔtcsD strain respectively, whereas the derivatives having ethyl side chain was observed in both ΔtcsB and ΔtcsD strains. Taken together, except for the four derivatives described above, nine FK506 derivatives were biosynthesized and seven of them were identified as new compounds. The combinatorial biosynthetic approach can be used to extend the structural diversity of FK506 and develop the novel agents with improved therapeutic properties. In Chapter V, the SAR of novel FK506 derivatives was established based on the immunosuppressive and antifungal activities against C. neoformans, C. albicans, A. fumigatus. Compared to 9-deoxo-31-O-demethylFK506 selected as antifungal agent candidate in Chapter III, the C9 and C21 modified derivatives exhibited similar or much lower immunosuppressive activity and were more advantageous to maintain antifungal activity except 9-deoxoFK523. However, the C31 and C21 modified derivatives exhibited the much higher inhibitory activity of T-cell proliferation despite their high antifungal activity. In addition, FK506 derivatives substituted at C9, C31 and C21 position greatly reduced not only inhibition of T-cell proliferation but also antifungal activity against all three pathogenic fungi. In addition, the synergetic efficacy test with fluconazole were evaluated for several derivatives. Taken together, the decarboxylation at C9 may be viable to discriminate between human and fungal FKBP12. Notably, the chemical structure of C21 side chain, which displayed the lowest IC50 values, was depending on the structure of FKBP-binding region. As a result, the 9-deoxoFK520 demonstrated the potential for a new antifungal against a broad spread of fungi. In summary, the detailed understanding of the SAR for the FK506 derivatives has allowed us to discover a potent new antifungal agent candidate, leading the possibility for the new antifungal agent against specific-fungi.;FK506은 면역억제활성을 갖고 있는 폴리케타이드로 1984년 일본에서 토양 방선균인 Streptomyces 종 tsukubaensis로 부터 발견되었고, 1994년도에 FDA의 승인을 받은 이후로 장기 이식 환자의 이식거부반응을 예방과 아토피성 피부염과 같은 자가면역질환의 치료제로 사용되고 있다. FK506은 면역억제활성 이외에도, 항진균활성, 신경재생활성 및 발모활성 등 다양한 약리활성을 가지고 있다고 알려져 있다. 그러나 면역억제활성 때문에 직접적으로 다른 약리활성을 이용하는데 어려움이 있다. 이에 본 연구는 생합성 유전자조합을 통해 FK506의 다른 약리활성을 이용할 수 있는 신규 유도체를 생산하고자 하였다. 또한 유도체의 활성실험을 통해 구조-활성 상관 관계를 규명하고자 하였다. 본 논문의 3장에서는 21번 위치의 알릴 측쇄 (tcsB, tcsD) 및 post-PKS 변형 (fkbD, fkbM)에 관여하는 유전자 삭제를 통해 기확인된 4종의 FK506 유도체를 분리∙정제하고, 각 유도체의 세포독성, 면역억제활성, 그리고 항진균활성을 측정하였다. 4 종의 유도체 모두 FK506보다 낮은 세포 독성 및 면역 억제 활성을 나타내었다. 그리고 9-deoxo-prolylFK506을 제외하고는, 유도체 모두 크립토코커스 네오포만스, 칸디다 알비칸스, 그리고 침윤성 사상균인 아스퍼질러스 푸미가투스에 대해 강력한 항진균 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 흥미롭게도, FKBP 결합 영역의 구조적 변형에 따른 항진균 활성은 면역 억제 활성과 동일한 순서 (31-O-demethylFK506, 9-deoxoFK506, 9-deoxo-31-O-demethylFK506 및 9-deoxo-prolylFK506)를 보였다. 이러한 결과는 FK506이 사람과 곰팡이 세포 모두에서 FKBP12와 칼시뉴린과의 삼원 복합체를 형성한다는 선행연구들과 일치한다. 더 나아가, 9-deoxo-31-O-demethylFK506 및 31-O-demethylFK506은 전신성 크립토코커스의 생체 내 모델에서 플루코나졸과 강력한 상승 작용을 갖는 것을 확인하였다. 결과를 종합했을 때, C9과 C31 위치에서의 변형이 인간 및 곰팡이 FKBP12에 대한 친화도를 조정하는 데에 영향을 끼친다는 것을 의미한다. 본 논문의 4장에서는 유사한 효능을 가지지 만 감소된 면역억제활성을 갖는 FK506 유도체를 개발하기 위해 광범위한 화학 변형이 수행되었다. FK506은 매우 복잡한 구조적 특성 때문에 화학적 방법을 통한 구조 변형에 다양한 어려움이 존재한다. 이에 본 장에서는 선행연구를 바탕으로, FkbD (사이토크롬 P450 수산화효소)를 결실시킴으로써 C1 또는 C9에서의 변형을 수행하였고, 31-O-데메틸 (demethyl) 유도체를 생성하는데 FkbM (메틸 전이 효소)의 결실을 이용하였다. 또한, FK506의 C21 측쇄는 TcsB 또는 TcsD의 인 프레임 결실에 의해 변형되었다. 각 유전자를 조합하여 삭제한 돌연변이 균주를 작제하고, 각 균주 배양을 통해 생합성 되는 유도체를 분리∙정제하여 구조를 동정하였다. 위의 4 가지 유사체를 제외하면, 9 개의 FK506 유사체가 분리되었으며, 그 중 7 개가 새로운 화합물이었다. 이러한 조합생합성 접근법은 FK506의 구조적 다양성을 확장하고 향상된 치료 특성을 갖는 신규 약제를 개발하는데 사용될 수 있음을 보여주었다. 마지막으로 본 논문의 5장은 조합생합성 접근법을 통해 생산된 9종의 유도체에 대해 면역억제 및 항진균 활성을 평가하여 유용 생리활성물질로의 활용이 가능함을 확인하였다. 3장에서 항진균제 후보 물질로 선택된 9-deoxo-31-O-demethylFK506과 비교했을 때, C9과 C21 변형 유도체는 유사하거나 훨씬 낮은 면역억제활성을 나타내었고, 9-deoxoFK523을 제외하고는 항진균 활성을 유지하는 데에 유리하다는 것을 확인하였다. 그러나, C31과 C21 변형된 유도체는 높은 항진균 활성을 나타내었지만, 반면 면역억제 활성 역시 훨씬 높았다. 또한, C9, C31, 그리고 C21 위치가 모두 변형된 FK506 유도체는 면역억제활성뿐만 아니라 3 가지 모든 병원성 진균에 대한 항진균 활성도 크게 감소하였다. 특히, 메틸 측쇄나 프롤린 고리 구조를 갖는 유도체의 경우 높은 농도에서 어떠한 활성도 나타내지 않았다. 더 나아가, 9-deoxoFK520, 9-deoxoFK523, and 9-deoxo-31-O-demethylFK520에 대해 플루코나졸과 강력한 상승 작용을 갖는 것을 확인하였다. 종합하여, 9-deoxoFK520이 광범위한 곰팡이 균에 대한 새로운 항진균제로의 가능성이 가장 높다고 판단된다. 또한 본 장에 제시된 데이터는 진균 종에 따라 달라지는 구조적 변형의 효과에 기초하여 특정 진균에 대한 새로운 항진균제의 합성 가능성을 제공한다. 이상의 연구결과는 폴리케타이드 계열 화합물인 FK506의 생합성 유전자 조합을 통해 다양한 유도체를 생산하고, 다양한 활성평가를 이용한 강력한 항진균제 후보 물질 선별에 관한 보고이다. 이와 같은 조합생합성 방법은 FK506뿐만 아니라 화학적 합성이 어려운 마크로라이드 구조 (macrolide scaffold)의 구조적 다양성을 확장하였다. 또한 FK506 유도체에 대한 구조-활성 상관관계는 향후 신규 신약후보물질을 효율적으로 개발하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 예상된다.