Structure-based Development of TRAP1 Selective Inhibitors and Modification of Lipophilic Cation Conjugated Coumarin Derivatives

Abstract

PART Ⅰ. Structure-based Development of TRAP1 Selective Inhibitors Hsp90 (Heat shock protein 90) is a molecular chaperone that helps other protein to fold properly, stabilizes ‘client’ proteins against stress conditions. Hsp90 is essential for cancer cell proliferation and is regarded as an anticancer target for over two decades. However, Hsp90 inhibitors developed so far showed moderate activity unexpectedly probably due to the pan-inhibitory activity against all four isoforms. Alternatively, development of Hsp90 paralog/isoform selective inhibitor is considered to be a good way to improve the limitations of previously developed Hsp90 inhibitors. In this study, I focused on TRAP1, mitochondrial heat shock protein 90 paralog, that is important for cancer energy metabolism and regarded as a tumor suppressor. Based on protein structure, I designed TRAP1 selective inhibitors and synthesized total 43 compounds. Several compounds showed good potency and improved TRAP1 selectivity over Hsp90 in comparison with current well-known Hsp90 inhibitors and existing most potent TRAP1 inhibitor compounds. PART Ⅱ. Synthesis of Lipophilic Cation Conjugated TRAP1 Inhibitors TRAP1 (Tumor necrosis factor receptor associated protein 1) is a mitochondrial heat shock protein 90 (Hsp90) paralog that regulates tumor cell energy metabolism and have been regarded as an attractive target for treatment of anticancer. To the date, several attempts have been made to develop TRAP1 inhibitor as anticancer therapeutics. However, it is difficult to make mitochondrial permeable compounds because of the complicated mitochondrial membrane system. As an alternative, attempts have been made to overcome the mitochondrial permeability issue using mitochondrial-targeted delivery, and delocalized lipophilic cation (DLC) is representative. The negative membrane potential of the mitochondrial inner membrane lead to the accumulation of the positively charged compounds inside the mitochondria. Their lipophilicity and resonance stabilized delocalization of the positive charge allows the compounds to easily pass through phospholipid bilayers. In this study, we synthesized several DLC-TRAP1 inhibitor conjugates to deliver the newly developed potent and selective TRAP1 inhibitor to the mitochondria inside using TPP mitochondrial targeting delivery moiety. Also, delivery moiety was changed to adjust the size and confirm the effect. PART Ⅲ. Modification of Lipophilic Cation Conjugated Coumarin Derivatives to Understand Mitochondrial Permeability Mitochondria is an important organelle that regulates energy metabolism and cell cycle in cancer cells. Many studies have shown that mitochondria play an essential role in the apoptotic mechanism and leads to cell death through disrupting electron and releasing proteins that mediate apoptosis or interfere with redox homeostasis. One of the well-known strategies for mitochondrial targeting is the concept of DLC (Delocalized Lipophilic Cation). Because of the negative charge inside the mitochondria, lipophilic cations can easily pass through the mitochondrial membrane. Due to the mitochondrial membrane potential, passed lipophilic cations accumulate in the mitochondrial inner membrane. The higher is the LogP value of the lipophilic cation, the greater is the accumulation of the compound inside the mitochondria. A representative mitochondrial targeting moiety in the DLC concept is triphenylphosphonium (TPP). Here, it will be determined how the extent or rate of accumulation of the TPP moiety changes when various substituents are attached to the phenyl ring or when the phenyl ring is converted to a simple alkyl chain. Through this study, the effect of the lipophilicity, charge distribution and size of the mitochondrial delivery moiety TPP can be confirmed.;PART Ⅰ. Structure-based Development of TRAP1 Selective Inhibitors Hsp90 (Heat shock protein 90)는 단백질이 적절히 접히도록 돕고 스트레스 조건에 대해 '클라이언트' 단백질을 안정화시키는 분자샤페론이다. Hsp90는 암세포 증식에 필수적이며 유망한 항암 타겟으로 여겨져 왔다. 그러나 지금까지 개발된 Hsp90 인히비터는 모든 paralog에 대한 pan-inhibition 활성으로 인해 독성 문제와 Hsp70 같은 보상적인 다른 pathway의 샤페론을 upregulation 시키는 등의 부작용을 보여 기대에 미치지 못한 효과를 보였다. 대안으로서 Hsp90 paralog/isoform에 선택적인 억제제의 개발이 이전에 개발된 Hsp90 억제제의 문제점들을 개선하는 좋은 방법으로 여겨진다. 본 연구에서는 암세포의 에너지 대사 및 종양 억제에 중요한 것으로 간주되며 heat shock protein 90의 paralog인 TRAP1을 타겟 단백질로 하였다. Hsp90와 TRAP1 단백질 구조에 기반하여 TRAP1에 선택적인 인히비터의 scaffold를 설계하고 총 43 가지 화합물을 합성했다. 몇몇 화합물은 현재 잘 알려진 Hsp90 인히비터 및 기존에 개발된 가장 강력한 TRAP1 인히비터와 비교하여 생체 외 실험에서 좋은 효능 및 TRAP1에 대한 개선된 선택성을 보였다. 이 결과는 앞으로 퓨린 계열의 TRAP1 인히비터를 개발할 때 선택성에 대한 중요한 단서를 제공할 것이다. PART Ⅱ. Synthesis of Lipophilic Cation Conjugated TRAP1 Inhibitors TRAP1 (TNF receptor-associated protein 1)은 암세포의 에너지 대사를 조절하며 항암 치료의 매력적인 타겟으로 간주되며 미토콘드리아에 있는 heat shock protein 90 (Hsp90)의 파라 로그이다. 현재까지 항암 치료제로서 TRAP1 인히비터를 개발하는 시도가 있었지만 복잡한 미토콘드리아의 막 시스템 때문에 미토콘드리아 투과성 화합물을 만드는 것이 쉽지 않았다. 대안으로 미토콘드리아를 타겟 하는 moiety를 이용하여 미토콘드리아 투과성 문제를 극복하기위한 시도가 있었고, Delocalized lipophilic cation (DLC) 화합물이 대표적이다. 미토콘드리아 내부의 음성 막 전위는 양전하를 띤 화합물의 미토콘드리아 내부의 축적을 유도한다. 그들의 친 유성 및 공명 안정화된 양전하의 비편재화는 화합물이 인지질 이중층을 쉽게 통과하여 축적되게 한다. 본 연구에서는 미토콘드리아를 타겟하는 대표적인 moiety인 TPP를 사용하여 새롭게 합성한 in vitro assay에서는 활성이 매우 좋았지만 cell-based assay에서 효과가 없었던 TRAP1 인히비터를 미토콘드리아 내부로 전달하기 위해 몇 가지 DLC-TRAP1 인히비터 conjugates를 합성했다. PART Ⅲ. Modification of Lipophilic Cation Conjugated Coumarin Derivatives to Understand Mitochondrial Permeability 미토콘드리아는 ATP를 생산하는 중요한 세포 내 소기관이다. 세포 사멸 메커니즘에 중요한 역할을 하며 전자 전달, 에너지 대사 및 세포 자살을 매개하거나 산화 환원 항상성을 방해하는 단백질 방출을 통해 세포 사멸을 유도한다고 알려져 있다. 미토콘드리아의 기능 장애는 암, 퇴행성 뇌 질환, 당뇨 등 많은 질병들과 연관되어 있다. 따라서 관련한 기능 연구나 약물 개발에 있어서 미토콘드리아의 막 투과성에 대한 이해가 중요하다. 미토콘드리아 타겟팅을 위해 잘 알려진 전략은 DLC (Delocalized Lipophilic Cation)가 미토콘드리아를 잘 통과하여 미토콘드리아 내막에 축적되는 것을 이용하여 small molecule을 DLC와 연결하여 생물학적 활성이 있는 물질을 타겟에 잘 도달하도록 하는 것이다. 그 중에서 대표적인 것이 Triphenylphosphonium (TPP+) moiety이다. 하지만 현재까지 이 TPP moiety 자체의 lipophilicity와 charge가 어느정도 되어야 하는지, 얼마나 친 유성의 성질을 가지는 small molecule을 데리고 들어갈 수 있는지 등에 대한 연구가 되어있지 않다. 본 연구에서는 TPP의 페닐 고리에 대한 다양한 치환기의 효과와 lipophilicity의 차이가 미토콘드리아 내부로 축적되는 정도에 주는 영향과 TPP가 전달할 수 있는 small molecule의 lipophilicity와 charge의 범위 등을 확인하고자 하였다. 따라서 dye를 하나 정하여 이와 TPP를 연결한 후 dye 부분과 TPP 부분을 변형시켜 봄으로써 그 상관관계를 보기 위해 다양한 lipophilic cation이 컨주게이트된 쿠마린 유도체들을 합성하였다.