1.Antibiotic tolerance of arctic psychrotolerant Pseudomonas sp. B14-6. 2.The development of a rapid antimicrobial susceptibility test.

Abstract

1. Bacteria can avoid antibiotics by entering a non-growing dormant state, which is called persisters without accompanying genetic modification. Bacteria in this state and this non-inheritable ability to resist multiple antibiotics are referred to as antibiotic tolerance. Despite all bacteria being considered capable of forming antibiotic-tolerant persisters, not much is known about the antibiotic tolerance of extremophilic bacteria. Here, I report the tolerance of Pseudomonas sp. B14-6, the psychrotolerant bacterium from the glacier foreland of Midtre Lovénbreen in High Arctic Svalbard, against aminoglycosides at various temperatures. Pseudomonas sp. B14-6 was susceptible to apramycin, gentamicin, kanamycin, and tobramycin. Unlike the mesophilic Pseudomonas aeruginosa PA14, this cold-adapted bacterium has been shown to reduce susceptibility to these aminoglycosides in a temperature-dependent manner. At a lower temperature, Pseudomonas sp. B14-6 not only forms the persister cells that exhibit tolerance to the 100-fold minimum inhibitory concentration (MIC) of gentamicin, but also the intermediate-tolerant cells that survive 25-fold MIC gentamicin. The temperature-dependent gentamicin tolerance appears to be due to decreased metabolic activity. Lastly, this bacterium can proliferate at low temperatures even under the growth inhibitory concentrations of aminoglycosides. These results that Pseudomonas sp. B14-6 has the proliferative ability by switching the intermediate tolerance to aminoglycosides can provide a meaningful database for antibiotic tolerance of extremophiles. 2. Antimicrobial resistance (AMR) remains a major problem that threatens human health faced around the world. In particular, Staphylococcus aureus is still leading a virulent pathogen that cause the AMR. Antimicrobial susceptibility testing (AST) systems can play a crucial role to prevent the current AMR issues by guiding the appropriate use of antibiotics through the determination of resistance and minimum inhibitory concentration (MIC) of drugs. The emergence and spread of AMR enhance the need for a rapid antimicrobial susceptibility test (RAST). The existing pathogen identification and AST takes more than 1 day, so it is necessary to shorten this time as short as possible to reduce the patient's mortality rate and enable rapid and accurate antibiotic therapeutic. Here, I developed a fast, accurate, and convenient AST. This method based on the levels of reactive oxygen species (ROS) in pathogens, a metabolite induced by exposure to antibiotics, to determine the MIC and resistance of drug. The total diagnosis time was only four and a half hours, which was at least 13 hours shorter than standard AST. The levels of intracellular ROS were measured by fluorescence, which increases when the bacteria are induced stress-response by antibiotics. As a result, the ROS-based AST (R-RAST) was tested against 30 S. aureus strains including methicillin-resistant and vancomycin-intermediate clinical isolates and could determine the MICs and resistance with similar trends to standard AST.;1. 박테리아는 별다른 유전자의 변형 없이도 자라지 않는 휴면 상태에 들어가 항생제의 영향을 피할 수 있는데, 이 상태를 퍼시스터(Persister)라고 한다. 이러한 상태의 박테리아와 이 때의 여러 항생제에 저항성을 가질 수 있게 하는 비유전적 능력을 antibiotic tolerance라고 한다. 모든 박테리아가 antibiotic-tolerant 퍼시스터를 형성할 수 있는 것으로 여겨지지만, 극지 박테리아의 tolerance에 대해서는 알려진 바가 많지 않다. 따라서 본 고에서는, 북극 고지대인 Scalbard에 있는 Midtre Lovénbreen의 빙하 전초지에서 획득한 녹농균의 한 종류인 B14-6의 다양한 온도의 아미노글라이코사드에 대한 torelence에 대해 보고하고자 한다. Pseudomonas sp. B14-6은 아프라마이신, 겐타마이신, 카나마이신 및 토브라마이신에 대해 감수성을 가졌다. 또한 중온성 녹농균인 PA14와는 달리, 차가운 환경에 적응된 Pseudomonas sp. B14-6는 온도에 의존적으로 아미노글리코사이드에 대한 감수성을 감소시키는 것으로 나타났다. 낮은 온도에서 Pseudomonas sp. B14-6은 겐타마이신의 최소 억제 농도(MIC)의 100배의 농도에서도 내성을 나타내는 퍼시스터를 형성할 뿐만 아니라, 25배 겐타마이신에서 살아남는 중간 내성 세포를 형성하는 것을 확인하였다. 이러한 온도 의존적 tolerance는 대사 활성의 감소에 의한 것으로 보였다. 마지막으로, 이 박테리아는 아미노글리코사이드의 성장 억제 농도에서도 온도가 낮아질수록 더욱 활발히 증식하였다. Pseudomonas sp. B14-6의 이러한 결과들은 극지방 미생물들의 항생제 tolerance에 대한 의미 있는 데이터베이스를 제공할 것이다. 2. 항균제 내성은 전 세계적으로 마주한 인간의 건강을 위협하는 주요한 문제이다. 특히나 황색포도상구균은 여전히 항균제 내성을 일으키는 독성 병원체들을 대표하고 있다. 항균제 감수성 검사 시스템은 약물의 내성 및 최소 억제 농도(MIC)를 제공함으로써 항생제의 적절한 사용을 권장하여 현재의 항균제 내성 문제를 예방하는 데 중요한 역할을 할 수 있다. 이러한 내성 문제의 출현과 확산은 신속한 항균 감수성 테스트(RAST)의 필요성을 증가시킨다. 기존에 사용하고 있는 병원체 진단과 항균제 감수성 검사는 적어도 하우 이상의 시간이 걸리므로 이 시간을 최대한 단축해 환자의 사망률을 낮추고 신속하고 정확한 항생제 치료가 가능하도록 해야 한다. 고로 본 고에서는 빠르고 정확하며 편리한 항균제 감수성 검사법을 개발하였다. 이 방법은 항생제에 노출되어 발생한 대사물질인 병원체 내 활성산소종(ROS)의 수치를 사용하여, 기존의 감수성 검사 보다 최소 13시간 이상 단축시킨 4시간 30분 이내에 약물의 최소 억제 농도와 내성을 확인할 수 있다. 세포 내 활성산소종의 수준은 형광 기반으로 측정되었으며, 박테리아가 항생제에 의해 유도된 스트레스 반응으로 활성 산소종이 증가함에 따라 형광이 증가한다. 이 활성산소종을 기반으로 한 항균제 감수성 검사(R-RAST)를 사용하여 임상에서 획득한 메티실린 내성 및 반코마이신 중간 내성균을 포함한 총 30개의 황색포도상구균에 대해 측정해보았으며, 기존의 검사법과 매우 유사한 결과를 얻었다.