Phenotypic changes of human natural killer cells induced by soluble factors secreted by cancer cells

Abstract

Natural Killer (NK) cells are important leukocytes in innate immune system and can attack transformed cells such as cancer and virus-infected cells. Activity of NK cells is determined by balance of activating and inhibitory signals generated from each their receptor. Recently, immune checkpoint inhibitors (ICIs) are focused as anti-cancer therapy improving T cell response. Cytotoxicity of T cell is suppressed by inhibitory checkpoint molecules expressed on cancer cell surface. This mechanism is well known in T cell but not NK cells. Also, effect of proteins derived from cancer cells on co-inhibitory receptors of NK cells is still elusive. It was considered that co-inhibitory receptors may be critical for NK cell function in cancer microenvironment. Therefore, I hypothesized that soluble factors secreted by cancer cells regulate the expression of co-inhibitory receptors on human NK cells. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were obtained from blood of healthy donor by Ficoll density gradient, and human NK cells were isolated from PBMC by magnetic- activated cell sorting. Flow cytometry was used to validate the change expression of activation markers, co-inhibitory receptors and activating receptors on human NK cells. To examine the phenotypic changes of human NK cells after treatment with cancer-conditioned media (CM), NK cells were primed with IL-12 and IL-15 and stimulated with CM. The expression of activation markers and co-inhibitory receptors on NK cells in each CM, except T47D CM, was significantly higher than that in negative control (NC). Also, A549 CM elicited to decrease the expression of activating receptors on NK cells in comparison with those in NC. To elucidate the effect of proteins found in ELISA, western blotting and proteome array on survival of patient with cancer, public genomes databases were used. Analysis of genomes by public databases represented negative correlation of TGF-β1, TNF, MCP-1, IL-8, Serpin E1, MIF and DKK-1 with survival in patient with cancer. To quantitate TGF-β1 and TNF-α levels, ELISA and Western blotting were used, and TGF-β1 and TNF-α marginally were expressed. Also, proteome array was used to identify proteins secreted by cancer cell lines. To investigate the phenotypic changes of human NK cells after treatment with proteins found in proteome array, NK cells were primed with IL-12 and IL-15 and stimulated with each recombinant protein, including TGF-β1, MCP-1, IL-8, Serpin E1 and MIF. These proteins did not affect the expression of co-inhibitory receptors on NK cells. 4-IPP, MIF antagonist, and a-DKK-1 antibody were used to examine the effect of MIF and DKK-1 on the NK cell phenotype. 4-IPP promoted to reduce the expression of not only co-inhibitory receptors but also CD56 on the surface of NK cells. In conclusion, although these recombinant proteins did not affect the phenotypic changes of NK cells, it was found that the expression of activation marker and co-inhibitory receptors was increased upon treatment with IL-12 and IL-15. It is necessary to find certain proteins determining the activity of NK cells, and therapy blocked against these proteins may help patients with cancer to cure in the future.;자연 살해 세포 (NK cell)는 선천면역계에서 중요한 림프구이며 암세포나 바이 러스에 감염된 세포와 같은 변형된 세포를 공격할 수 있다. 자연살해세포의 활성 화는 활성화 수용체와 억제 수용체에서 각각 생성된 각각의 신호들의 균형에 의 해 결정된다. 최근에, 면역관문억제제는 T 세포의 반응을 증진시키는 항종양치료 제로 주목받고 있다. T 세포의 세포 독성은 암 표면에서 발현되는 억제관문분자에 의해 억제가 되고 있다. 이 메커니즘은 T 세포에서 잘 알려져 있지만 자연살해세 포에서는 알려져 있지 않다. 또한, 종양 세포에서 유래된 단백질이 자연살해세포 의 공동 억제 수용체에 미치는 영향에 대해서 아직 알려지지 않았다. 종양미세환 경 안에서 공동 억제 수용체가 자연살해세포 기능에 중요 할 것으로 생각된다. 그 러므로, 본 연구에선 종양 세포에 의해 분비되는 분자가 자연살해세포의 공동 억 제 수용체의 발현을 조절한다는 가설을 세웠다. 말초혈액단핵세포 (PBMC)가 Ficoll 밀도 구배에 의해 정상인의 혈액으로부터 채취되었고, 사람 자연살해세포는 자성 세포 분류에 의해 말초혈액단핵세포로부터 분리되었다. 유세포 분석기는 사람 자연살해세포에서 활성화 마커들, 공동 억제 수용체 및 활성화 수용체의 발현을 확인하기 위해 사용되었다. 암 조건 배지의 처 리 후 사람 자연살해세포의 표현형 변화를 조사하기 위해, 자연살해세포를 IL-12 와 IL-15로 프라이밍하고 암 조건 배지로 자극시켰다. T47D 암 조건 배지를 제 외한 암 조건 배지에서 자연살해세포에 활성화 마커들과 공동 억제 수용체들의 발현이 음성 대조군에서보다 유의미하게 더 높았다. 또한, A549 암 조건 배지는 자연살해세포의 활성화 수용체 발현이 음성 대조군에 비해 감소되도록 이끌었다. ELISA, 웨스턴 블랏 및 프로테옴 어레이에서 발견된 단백질이 암 환자의 생존에 미치는 영향을 설명하기 위해 public genomes database가 사용되었다. Public database에 의해 게놈의 분석은 TGF-β1, TNF, MCP-1, IL-8, Serpin E1, MIF 및 DKK-1이 암환자의 생존과 음의 상관관계임을 나타냈다. TGF-β1와 TNF-α의 수준을 정량 하기 위해 ELISA, 웨스턴 블랏이 사용되었고, TGF-β1와 TNF-α이 약하게 발현되었다. 또한, 프로테옴 어레이가 암 세포주에서 분비된 단백질을 알 기 위해서 사용되었다. 프로테옴 어레이에서 발견된 재조합 단백질을 처리 후에 사람 자연살해세포의 표현형 변화를 조사하기 위해 자연살해 세포를 IL-12와 IL-15로 프라이밍 하였고 TGF-β1, MCP-1, IL-8, Serpin E1 및 MIF을 포함한 재조합 단백질 각각으로 자극시켰다. 이러한 단백질들은 자연살해세포에 공동 억 제 수용체 변화에 영향을 미치지 않았다. MIF의 길항제인 4-IPP와 a-DKK-1 항 체는 MIF와 DKK-1가 자연살해세포의 표현형에 미치는 영향을 조사하기 위해서 사용되었다. 4-IPP는 자연살해세포 표면에 공동 억제 수용체의 발현 뿐 아니라 CD56 발현도 감소하도록 촉진하였다. 결론적으로 이러한 재조합 단백질들이 자연살해세포의 표현형 변화에 영향을 확인하지는 못했지만, IL-12와 IL-15의 처리시에 활성화 마커들과 공동 억제 수 용체 비율이 증가되는 것을 발견하였다. 자연살해세포의 활성화를 결정하는 특정 단백질을 찾는 것이 필요하며, 이러한 단백질들을 억제하는 치료 요법은 향후에 암 환자들을 치유하는데 도움을 줄 수 있을 것이다.