구강 미생물 채취법 및 치주염 치료법에 따른 구강 마이크로바이옴 분석

Abstract

This study aimed to compare the sample differences and the effectiveness of the oral microbiome according to periodontitis diagnosis and collection methods (unstimulated saliva, gingival sulcus plaque). The association between the sampling methods was analyzed through the pattern of changes in the oral microbiome after mechanical treatment (scaling) and antimicrobial treatment (chlorhexidine). Unstimulated Saliva and Gingival sulcus plaque samples were performed at T0 (time point 0: baseline, enroll, sampling) and T1 (time point 1: prognosis, sampling) for six periodontally healthy groups and 12 periodontitis groups. At T0, mechanical treatment (scaling) or antimicrobial treatment (chlorhexidine) was applied. For samples, 5ml of unstimulated saliva and gingival sulcus plaque (swabbing method) were collected from T0, and T1. Next-generation sequencing was used for the collected samples by amplifying and analyzing the V4 region of the 16s rRNA gene from DNA. We compared the diversity and relative abundance of microbial composition in the oral cavity with unstimulated saliva and gingival sulcus plaque samples before and after treatment in the periodontally healthy and periodontitis groups. An average of 216 OTUs (Operational Taxonomic Units) were identified in the sample. The total microbial diversity was higher in the gingival sulcus plaque sample than in the unstimulated saliva sample in both periodontally healthy and periodontitis groups. Depending on the collection method at T0, various bacteria were identified in the periodontitis groups than in the periodontally healthy groups. According to the time point, bacteria that could serve as taxonomic biomarkers were identified in the periodontally healthy groups treated with mechanical treatment, the periodontally healthy groups treated with chemical treatment, and the periodontitis groups treated with mechanical treatment. Also, g_Actinotignum and s_Actinomycetaceae bacterium were higher at T0. H. pittmaniae was a species with a decrease in the total amount post-treatment (T1) in unstimulated saliva. Post-treatment (T1), there was no significant difference, but the diversity of species in the sample in both the periodontally healthy and periodontitis groups were higher in gingival sulcus plaque than in unstimulated saliva. Alternatively, the number of bacteria was higher in unstimulated saliva than in the gingival sulcus plaque in both periodontally healthy and periodontitis groups. In both sampling methods, gingival sulcus plaque was more common than unstimulated saliva in both the periodontally healthy and periodontitis groups to which chlorhexidine was applied. On one hand, unstimulated saliva was abundant in the periodontally healthy group and periodontitis group after scaling treatment compared to the gingival sulcus plaque. There was no significant difference in oral microbiome abundance and diversity before and after intervention (T0, T1), but the abundance and diversity increased after intervention except for the gingival sulcus plaque groups in the periodontally healthy groups following scaling intervention. The research showed that the gingival sulcus sampling method distributed more diverse strains than the unstimulated saliva collection method, and bacterial community variation was more abundant in the unstimulated saliva sample than in the gingival sulcus plague. In the gingival sulcus sampling method, more diverse strains were found than the unstimulated saliva collection method.;본 연구는 치주염 진단과 채취법 (비자극성 타액, 치은 열구 치태)에 따른 구강 마이크로바이옴의 차이와 그 유효성을 비교하고자 하였으며, 기계적 (스케일링) 혹은 항균세정 (클로르헥시딘) 후 구강 내 마이크로바이옴 (Microbiome)의 변화 양상을 통해 치료법에 따른 연관성 또한 분석하고자 하였다. 비자극성 타액과 치은 열구 치태는 T0 (time point 0: baseline, enroll, sampling)와 T1 (time point 1: prognosis, sampling)에서 6명의 정상군과 12명의 치주염군을 대상에게서 채취되었다. T0에서 기계적 (스케일링) 혹은 항균세정 (클로르헥시딘)치료를 시행했다. 시료는 T0와 T1에서 비자극성 타액 5ml, 치은 열구 치태 (swabbing 방식)가 채취되었다. 채취된 시료는 DNA에서 16s rRNA유전자의 V4영역을 증폭하여 분석하는 차세대 염기서열분석법 (Next Generation Sequencing, NGS)을 사용하였다. 정상군과 치주염군의 치료 전 후에서 비자극성 타액과 치은 열구 치태 시료에 따른 구강 내 미생물 조성의 다양성과 상대적 풍부도 (abundance)를 비교하였다. 평균 216개의 OTUs (Operational Taxonomic Units)가 시료에서 식별되었으며, 미생물균의 다양성은 정상군과 치주염군 모두 치은 열구 치태 시료가 비자극성 타액 채취법보다 총량이 많았다. T0 시점에서는 채취법에 따라 정상군보다 치주염군에서 다양한 균이 확인되었다. 치료 전후에서 스케일링을 시행한 정상군, 클로르헥시딘을 적용한 정상군과 스케일링을 시행한 치주염군에서 분류학적 바이오마커 (taxonomic biomarker)역할을 할 수 있는 균이 확인되었으며, 속 (genus)의 Actinotignum, 종 (species) 수준의 Actinomycetaceae bacterium이 T0에서 유의하게 높았다. 비자극성 타액에서 치료 후 (T1) 총량이 감소한 종으로는 Haemophilus pittmaniae가 있었다. 치료 후 (T1), 유의한 차이는 없었으나 정상군과 치주염군 모두 시료 내 종의 다양성은 치은 열구 치태가 비자극성 타액보다 높았다. 반면, 균의 총량은 정상군과 치주염군 모두 치은 열구 치태보다 비자극성 타액에서 높았다. 두 채취법에서 클로르헥시딘을 적용한 정상군과 치주염군 모두 치은 열구 치태가 비자극성 타액보다 풍부하였다. 반면, 스케일링 적용 후 정상군과 치주염군에서는 치은 열구 치태보다 비자극성 타액의 총량이 많았다. 치료 전과 후 (T0, T1), 균의 총량과 다양성에서 유의한 차이는 없었으나 스케일링 치료에 따른 정상군의 치은 열구 치태 그룹을 제외하고 모두 치료 후 총량과 다양성이 증가하였다. 본 연구를 통해 치주염 및 구강건강과 관련 있는 Eubacterium infirmum group, Solobacterium moorei, Filifactor alocis 균이 정상군과 치주염군 모두 치은 열구 치태에서 차이를 보였다. 정상군과 치주염군 모두 치은 열구 채취법이 비자극성 타액 채취법보다 다양한 균이 분포되어 있음을 알 수 있었으며, 군집 내 다양성은 치은 열구 치태보다 비자극성 타액 시료에서 풍부 (abundance)하였다.