Neuroprotective effect of Dexmedetomidine on autophagy of Aβ25-35 intracerebroventricular injected mice

Abstract

Dexmedetomidine (Dex)는 선택적 α₂ 아드레날린 수용체 작용제로 임상적으로 주술기 진통과, 중환자실에서 진정을 위해 사용되는 약제이다. 최근 마취 보조제로서 Dex 가 노인 및 퇴행성 뇌질환을 지닌 노인환자의 우수한 진통 효과 및 수술 후 섬망의 발생 감소와 관계 있다는 임상 연구가 발표되었으나, Dex의 신경보호 기전에 대한 연구결과는 아직까지 근거가 부족하다. 알츠하이머 병은 퇴행성 뇌질환 중 가장 많은 발생률을 차지하는 질환으로, 자가포식-리소솜 기전의 이상이 주요 발병 기전으로 알려져 왔다. 이에 우리는 amyloid β-protein fragment 25–35 (Aβ25–35)를 이용한 알츠하이머 생쥐 모델에 Dex를 처리했을 때, 신경보호 효과를 보일 것이라는 가설을 세우고 실험을 진행하였다. 쥐의 기억과 학습능력을 평가하기 위해 행동실험을 하였고, 생쥐의 해마에서 자가포식 및 기억 관련 단백질을 분석하여 Dex의 신경보호 효과와 자가포식 기전의 연관성을 증명하고자 하였다. 또한 Aβ25-35 처리한 쥐 해마 조직 절편 배양모델로 생체 외 실험을 진행하였다. 생체 내 실험에서 총 137 마리의 8-10주령의 C57BL/6 생쥐가 사용되었고, 쥐의 뇌실 내 (intracerebroventricular, ICV)에 Aβ25-35 (10 nmol/3 μl) 또는 saline 투여 후 2주 뒤, 복강 내로 Dex (40 µg/kg 또는 80 µg/kg)를 투여하거나 동량의 saline을 30분 간격으로 2회 투여하였다. 생쥐는 뇌실 및 복강 투여 약물에 따라 다음과 같이 saline ICV + saline IP (대조군, n = 23); saline ICV + Dex 40 µg/kg IP (D40군, n = 21); saline ICV + Dex 80 µg/kg IP (D80군, n = 24); Aβ25-35 ICV + saline IP (Aβ군, n = 25); Aβ25-35 ICV + Dex 40 µg/kg IP (Aβ/D40군, n = 23); Aβ25-35 ICV + Dex 80 µg/kg IP (Aβ/D80군, n = 21) 여섯 그룹으로 나누었다. 행동실험은 복강 내 약물 투여 후 1일, 3일, 7일에 각각 시행되었으며, 행동실험이 끝난 생쥐는 희생되어 뇌의 왼쪽 해마는 Western blot 단백 분석, 오른쪽 해마는 면역형광염색 분석을 위해 사용되었다. 생체 외 실험에서는 8일령의 Sprague-Dawley 쥐의 뇌를 분리하여 해마 조직 절편 배양모델을 만들고, 2.5 μM Aβ25–35 용액과 동시에 Dex를 0, 0.5, 1, 2.5, 5 μM 농도로 배지에 3일간 투여하여propidium Iodide (PI) 실험을 하였다. 또한 2.5 μM Aβ25–35 용액에 Dex를 1 또는 2.5μM 두가지 농도로 투여하여 Western blot으로 postsynaptic density-95 (PSD-95), phosphorylated Ca2+ /calmodulin-dependent protein kinase II (p-CaMKII), microtubule-associated protein light chain3-II (LC3-II), p62, lysosome-associated membrane protein2 (LAMP2) 단백을 분석하였다. Y maze 행동실험결과 Aβ군에서 대조군에 비해 교체행동비율이 복강 투여 후 1일과 7일에서 감소하였으나 Aβ/D40 군에서 복강 투여 후 7일째 Aβ군에 비해 의미 있게 회복되었다. 그러나 saline ICV 쥐들은 Dex 처리와 무관하게 유의미한 차이를 보이지 않았다. 또한 Aβ군에서 p-tau 단백이 대조군에 비해 유의미하게 증가하였으며, Aβ/D40 군에서 Aβ군에 비해 p-tau 단백의 강도가 1, 3, 7 일째 모두 유의미하게 감소했다. CA3 영역의 해마세포 면역형광 염색의 현미경 사진에서도 Aβ군에서 증가된 p-tau가 Dex (40 μg/kg) 투여 후 발현이 감소하였다. 이에 따라 기억력 관련 단백인 PSD-95 와 p-CaMKII은 Aβ/D40 군에서 Aβ군에 비해 각각 통계적으로 유의미하게 증가 및 감소되는 결과를 보였고, 자가포식 관련 단백 LC3-II, p62, LAMP2는 Aβ군에서 대조군에 비해 복강 투여 1, 3, 7 일째 모두 유의미하게 증가하였으나, Aβ/D40 군에서는 Aβ군에 비해 7일째 유의미하게 감소했다. 이를 뒷받침하는 면역형광 염색결과로 Aβ군에서 결합(co-localized) 되어 관찰되던 LC3 와 p62의 발색이 Aβ/D40 군에서는 겹치지 않고 따로 보였다. 생체 외 실험에서 Aβ25–35 처리한 해마 조직 절편에 각각 다른 농도의 (0.5, 1, 2.5, 5 μM) Dex 투여 시 Aβ25–35만 처리한 배지에 비해 해마세포의 PI 흡수가 감소했다. 또한 Aβ25–35 배지에 2 가지 농도로 (1 또는 2.5 μM) Dex를 투여한 후 p-tau 단백을 분석한 실험에서는 Aβ25–35 단독 처리군과 Dex 2.5 μM를 단독처리한 군에서 p-tau가 유의미하게 높게 나왔고, Aβ25–35와 Dex 1 μM 처리 군에서는 Aβ25–35만 처리한 군에 비해 유의하게 p-tau 단백이 감소했다. PSD-95는 Aβ25–35 단독 처리군과 Dex 2.5 μM 단독처리군에서 대조군에 비해 유의미하게 감소했고, p-CaMKII는 의미 있게 증가하는 양상을 보였으며, Dex (1 μM)와 Aβ25–35 동시 처리 시 이와 같은 결과가 반전되었다. 자가포식 관련 단백인 LC3-II, p62, LAMP2 은 Dex (1 μM)과 Aβ25–35 동시 처리군에서 Aβ25–35 단독 처리군에 비해 유의미하게 감소했다. 결론적으로 저농도의 Dex가 Aβ25-35 모델에서 기억 및 학습 저하를 완화시킨다는 것을 Y-maze 행동실험과 p-CaMKII 와 PSD-95 관련 신호전달 체계를 이용하여 확인하였으며, 이러한 신경보호 효과는 autophagic flux의 개선과 연관이 있음을 밝혀냈다. 따라서 알츠하이머 병 환자에서 Dex의 임상 사용시 신경보호 효과를 기대해 볼 수 있을 것으로 생각된다.

;Dexmedetomidine (Dex) is a highly selective α₂ adrenergic receptor agonist that is clinically used for perioperative analgesia or sedation in patients in the intensive care unit. Dex has the advantage of being used as an anesthetic adjuvant to general anesthesia for the elderly with or without degenerative brain diseases, such as Alzheimer's disease (AD), since it has analgesic effects and can prevent postoperative delirium. The pathological mechanism of AD is thought to be dysfunction of the autophagy-lysosomal pathway. However, there is a lack of evidence regarding the neuronal effects of Dex on autophagy dysfunction in mice with AD. Therefore, we hypothesized that administration of Dex could have neuroprotective effects on pathological autophagy dysfunction in amyloid β-protein fragment 25–35 (Aβ25–35) intracerebroventricular (ICV) injected mice model. Y-maze behavior tests were used to assess spatial working memory function, and memory- and autophagy-related proteins were analyzed in the hippocampus to explore the neuroprotective effects of Dex on ICV Aβ25-35 in mice. Moreover, an autophagic deficit model of organotypic hippocampal slice cultures (OHSCs) with Aβ25–35 solutions was used to detect autophagic changes induced by Dex in the hippocampus. A total of 137 C57BL/6 mice (weight, 25 ± 3 g; age, 8-10 weeks) underwent surgery for ICV injection of Aβ25-35 (10 nmol/ 3 μl per mouse) or ICV injection of saline (3 μl), followed by Dex (40 µg/kg or 80 µg/kg) or saline injected intraperitoneally (IP) twice at 30-min intervals. The mice were allocated to six groups according to the type of drug: saline ICV + saline IP (control, n = 23); saline ICV + Dex 40 µg/kg IP (D40, n = 21); saline ICV + Dex 80 µg/kg IP (D80, n = 24); Aβ25-35 ICV + saline IP (Aβ, n = 25); Aβ25-35 ICV + Dex 40 µg/kg IP (Aβ/D40, n = 23); and Aβ25-35 ICV + Dex 80 µg/kg IP (Aβ/D80, n = 21). The Y maze behavior test was conducted at 1, 3, and 7 days after IP injection. Following the behavioral test, the mice were decapitated and the hippocampal tissue from the left and right hemispheres were used for western blot analyses and immunofluorescence staining, respectively. In ex vivo experiments, the brains of 8-day-old Sprague-Dawley rats were used to conduct OHSCs. We applied a 2.5 μM concentration of Aβ25–35 solution with or without treatment of DEX 0.5, 1, 2.5 and 5 μM to the culture medium for 3 days. Propidium iodide (PI) was added to the culture medium and the following proteins were analyzed by western blotting: postsynaptic density-95 (PSD-95), phosphorylated Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (p-CaMKII), microtubule-associated protein light chain 3- II (LC3-II), p62, and lysosome-associated membrane protein2 (LAMP2). Group Aβ showed a significant decrease in the percentage of alternation compared to the control on days 1 and 7 and subsequently, the percentage of alternation in group Aβ/D40 recovered almost to the level of the control on day 7. However, there was no significant difference in the percentage of alternation among saline ICV groups (control, D40, and D80), regardless of Dex administration. Moreover, a significant increase in the intensity of p-tau was observed in the group Aβ compared to the control, and treatment of mice with Dex (40 μg/kg) significantly reduced the intensity of p-tau on days 1, 3, and 7 in Aβ25-35-administered mice. The microscopic images of p-tau in the pyramidal cell layer were increased in group Aβ, and a significant decrease following Dex (40 μg/kg) was observed in Aβ25-35-administered mice. Group Aβ/D40 mice showed a significant increase and decrease in the intensity of PSD-95 and p-CaMKII, respectively, compared to the group Aβ. There were significant increases in the intensity of LC3-II, p62, and LAMP2 levels in the Aβ group compared to the control on days 1, 3, and 7, and significant decreases in those proteins after administration of 40 μg/kg of Dex, compared to group Aβ on day 7. Immunofluorescence staining revealed that there were significant increases in the co-localized immunoreactivity of LC3 and p62 in the group Aβ, and significant dissociation of LC3 and p62 was demonstrated in group Aβ/D40 on day 7. In ex vivo experiments, administration of Dex at four different concentrations (0.5, 1, 2.5, and 5 μM) to OHSCs treated with Aβ25–35 solution resulted in significantly decreased uptake of PI, compared to OHSCs treated with Aβ25–35 only. A significant increase in the intensity of p-tau was observed in the Aβ25–35-only treated OHSCs; however, administration of 1 μM of Dex to the Aβ25–35 solution attenuated the production of p-tau compared to Aβ25–35-only treated OHSCs. For memory-related proteins, p-CaMKII were significantly increased and PSD-95 decreased in OHSCs treated with only Aβ25–35 compared to the control; furthermore, these results were reversed in the cultures treated with Dex (1 μM) and Aβ25–35. The autophagy-related proteins, such as LC3-II, p62, and LAMP2 significantly decreased when Dex (1 μM) was added to Aβ25–35 solution, compared to Aβ25–35 treatment alone. In conclusion, the present study demonstrated that low-dose Dex could attenuate memory and learning impairments in Aβ25-35 ICV injected mice via signaling pathways regulated by p-CaMKII and PSD-95. We confirmed the neuroprotective mechanism of low-dose Dex, which is associated to its alleviation of impairment of autophagic flux. These findings suggest that Dex could be clinically used as a neuroprotective adjuvant in anesthesia for patients with AD.