The effect of choline alfoscerate on isoflurane-induced toxicity in primary human astrocytes

Abstract

Isoflurane is one of the most widely used inhalational anesthetics. However, there has been a concern that isoflurane may potentially cause postoperative cognitive problems including delirium, cognitive dysfunction, and dementia, which are mainly attributable to isoflurane-induced toxicity in neurons and astrocytes. The astrocytes are the most abundant cell type in the brain, and the functional importance of which has been strongly emphasized because of their involvement in cognitive function. Therefore, the protection of astrocytes against isoflurane-induced toxicity is an important challenge. Much attention has been given to the oxidative stress theory for mechanisms underlying isoflurane-induced toxicity. For therapeutic aspects, the inhibition of the oxidative stress is an appropriate strategy to counter isoflurane-induced toxicity. Choline alfoscerate (L‐alpha‐glycery-lphosphorylcholine; α-GPC), which is widely used in clinical practice as a cognitive function enhancer, has neuroprotective effect via reducing levels of cellular oxidative stress. However, the heterogeneity in the effect of α-GPC has been suggested, thus an optimal therapeutic window of α-GPC needs to be considered for its application. The present study was conducted using primary human astrocytes. Cell viability was evaluated with water-soluble tetrazolium salt (WST)-1 assay and morphological changes were observed under a light microscope. To examine the effect of α-GPC pretreatment on human astrocytes which were exposed to 2.5% isoflurane, the cells were pretreated with vii α-GPC at concentration of 0.1 to 10.0 μM for 24 hours, then exposed to 2.5% isoflurane for the next 24 hours. The α-GPC treatment alone from 0.1 to 10.0 μM for 48 hours did not affect cell survival. However, 10.0 μM α-GPC pretreatment reduced viability of human astrocytes exposed to 2.5% isoflurane. The morphological damage was also markedly reveled when astrocytes pretreated with 10.0 μM α-GPC were exposed to 2.5% isoflurane. To further investigate mechanisms underlying this effect, we evaluated expression level of several genes of predicted factors to be involved in isoflurane-induced cytotoxicity and cytoprotective function by quantitative real time-polymerase chain reaction (qRT-PCR) ; heme oxygenase-1 (HO-1), hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) and receptors of brain derived neurotrophic factor (BDNF). The result showed that gene expression of antioxidant enzyme HO-1 were downregulated by pretreatment of α-GPC prior to exposure to isoflurane. In addition, gene expression of p75 neurotrophin receptor (p75NTR) and tropomyosin-related kinase B (TrkB) receptor, which are BDNF receptors, were suppressed in α-GPC pretreated group. The p75NTR removes proapoptotic factors that are excessively produced by isoflurane and induces antioxidant gene expression together with tropomyosin-related kinase B (TrkB) receptor. Thus downregulated BDNF receptors would impair the ability of human astrocytes exposed to isoflurane-induced toxicity. Hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) is a factor with opposing functions in relation to isoflurane-induced toxicity. The upregulation of HIF-1α expression has been reported to cause an imbalance of intracellular calcium ions, leading to cytotoxicity, whereas the short-term administration of isoflurane as a preconditioning agent has a protective effect against neurotoxicity caused by isoflurane by upregulation of HIF-1α. In this study, we found that the expression of HIF-1α was further suppressed in the α-GPC pretreated group. Therefore, it is presumed that HIF-1α was involved in a neuroprotective pathway. However, considering that it would have been unlikely for isoflurane to exert a preconditioning effect given our study design and that treatment of α-GPC alone does not reduce the expression of HIF-1α, further studies are necessary to fully understand this result. The altered phosphorylation of intracellular kinases were investigated by proteome profiler analysis. It showed that α-GPC pretreatment suppressed phosphorylation of heat shock protein (Hsp) 60, signal transducer and activator of transcription3 (STAT3), 90 kDa ribosomal S6 kinase (RSK)1/2, Hsp27, c-Jun, protein kinase B (AKT) 1/2/3 and proline-rich AKT substrate of 40 kDa (PRAS40) , which are components of the antioxidant intracellular signaling system. In conclusion, we demonstrated for the first time that administration of 10.0 μM α-GPC made human astrocytes more susceptible to isoflurane-induced toxicity in comparison to non-treated cells. We suggest that the mechanism underlying this finding may relate to reduction of the expression of factors which are associated with antioxidative function, eventually predisposing astrocytes towards increased cellular damage.;이소플루란(Isoflurane)은 전신마취 시 가장 많이 사용되는 흡입 마취제 중 하나이다. 그러나 임상적 허용 수준 내에서도, 약물의 농도 및 노출 시간 등에 따라 잠재적 세포 손상이 발생할 수 있음이 밝혀지고 있으며, 뇌에 가장 많이 분포하고 있는 성상교세포(astrocytes)에도 세포 독성을 초래하는 것으로 알려져 있다. 이에 세포들의 손상을 최소화하는 목적으로서 이소플루란에 의한 세포 손상 주요 기전인 산화스트레스로부터 세포를 보호하는 방법을 고려할 수 있다. 콜린 알포세레이트 (choline alfoscerate; α-GPC)는 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier) 통과 용이성이 입증된 뇌기능 개선제로, 항산화 기능을 갖고 있으며, 아세틸콜린 전구체를 보충하여 콜린 결핍성 질환에서 임상적 효과가 있음이 밝혀져 있다. 그러나 이 약제는 일부 동물 및 세포 실험에서 α-GPC의 노출 시간이나 대상 세포의 종류에 따라 독성이 나타날 수 있음이 보고되었다. 따라서 α-GPC에 대한 인간 성상교세포의 반응이나 α-GPC와 마취 약제 간의 상호 작용에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없기 때문에 이에 대한 연구가 필요하다. 본 연구에서는 인간뇌-일차 성상교세포를 사용하였으며, 생존성은 water-soluble tetrazolium salt (WST)-1 assay로 분석하였다. 먼저, 인간 성상교세포에 α-GPC를 0.1 μM, 1.0 μM, 10.0 μM의 농도에서 48시간 동안 단독 처리한 결과, 해당 농도 및 노출 시간에서는 생존성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 다음, α-GPC의 전처치 효과를 확인하기 위해, 0.1 μM 부터 10.0 μM의 농도에서 24시간동안 전처치를 시행하고, 이후 세포 독성 발생하는 것으로 확인된 농도인 2.5%의 이소플루란에 24시간 노출시켰다. 그 결과 0.1 μM, 1.0 μM 농도에서는 대조군과 생존성 차이를 보이지 않았으나, 10.0 μM 농도의 α-GPC 전처치 한 경우에는 생존성이 오히려 감소하였다. 이러한 생존성 감소의 원인을 알아보기 위해 이소플루란에 의한 세포 독성 발생 및 보호 기전과 관련된 인자들이 α-GPC의 전처치에 따라서 발현의 차이가 발생하는지 quantitative real time - polymerase chain reaction (qRT-PCR) 분석을 통해 유전자 수준에서 확인해 보았다. 먼저 이소플루란에 의한 세포 독성 유발의 주요 기전이 산화 스트레스이므로, 항산화 효소로 잘 알려진 heme oxygenase-1 (HO-1)의 발현을 비교해본 결과, α-GPC 전처치군에서 더욱 억제된 것을 확인하였다. 또한 brain derived neurotrophic factor (BDNF) 수용체인 p75 neurotrophin receptor (p75NTR) 가 이소플루란에 의해 과도하게 생성되는 세포사멸 인자들을 제거하고, tropomyosin-related kinase B (TrkB) 수용체와 함께 항산화 유전자 발현을 유도하여 세포를 보호하기 때문에, 이 수용체들의 변화가 α-GPC에 의한 효과와 관련되어 있을 것으로 추정하고 비교해본 결과, α-GPC 전처치군에서 하향 조절된 것을 확인하였다. Hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α)는 이소플루란에 의한 독성 발생 또는 독성으로 부터 보호하는 기능에 관여하는 이중적 인자로서, HIF-1α 발현의 상향 조절은 세포내 칼슘 이온의 불균형을 유발하여 세포 독성을 유발하거나, 이소플루란을 preconditioning agent로 단기간 투여 시에는 이소플루란에 의한 신경 독성에 대해 보호 효과를 갖는다고 보고되었다. 본 연구에서 α-GPC 전처리에 의해 세포 사멸이 더 많이 발생한 군에서 HIF-1α의 발현이 더욱 억제된 것으로 나타났다. 따라서 HIF-1α는 neuroprotective pathway 관련 인자로 작용했을 것으로 추정된다. 그러나 본 연구 설계상 preconditioning 효과가 발생할 조건이 아니며, α-GPC 단독 처리로는 HIF-1α 발현이 감소하지 않았다는 점을 고려할 때, 이 결과를 해석하는 데에는 제한점이 있다. 이와 같은 항산화 인자들의 유전자 수준에서의 발현의 변화가 단백질 수준에서도 양립성을 갖는지 확인하기 위해, proteome profiler array 분석을 시행하여 세포내 신호전달체계 관련 키나아제들의 활성도의 변화를 비교하여 보았다. 그 결과 α-GPC 전처치로 인해 항산화 작용에 관여하는 heat shock protein (Hsp) 60, signal transducer and activator of transcription3 (STAT3), 90 kDa ribosomal S6 kinase (RSK)1/2, Hsp27, c-Jun, protein kinase B (AKT) 1/2/3 그리고 proline-rich AKT substrate of 40 kDa (PRAS40) 의 활성이 억제된 것을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구에서는 10.0 μM α-GPC 전처치는 항산화 인자들의 발현 억제와 항산화 작용에 관련된 세포 신호 전달 체계의 활성화 억제로 인간 성상교세포를 이소플루란 노출에 의한 세포 독성에 더욱 취약하게 만든다는 사실을 확인하였다.