Functional studies of Fas-associated factor 1 on immune response and cell motility

Abstract

Fas-associated factor 1 (FAF1), a member of UBXN family containing multiple ubiquitin related domains that include an ubiquitin-associated (UBA) domain, ubiquitin-like 1, 2 (UBL1, UBL2) domains and ubiquitin regulatory X (UBX) domain. Previous studies show that FAF1 plays multiple biological functions including apoptosis, protein degradation and regulation of chaperone activity. The first part of this has been designed to investigate the comprehensive cellular functions of FAF1 employing microarray analysis. This analysis disclosed that interferon stimulated genes related to antiviral response are significantly increased in FAF1 knocked down HeLa cells. Silencing FAF1 enhanced the poly I:C and respiratory syncytial virus (RSV) induced productions of type I interferons (IFNs), the target genes of interferon regulator factor 3 (IRF3). IRF3 is a key transcription factor in IFNβ signaling responsible for host innate immune response. This study also found that FAF1 and IRF3 physically associate with IPO5/importin-β3 and that overexpression of FAF1 reduces the interaction between IRF3 and IPO5/importin-β3. These findings suggest that FAF1 negatively regulates IRF3-mediated IFNβ production and antiviral innate immune response by regulating nuclear translocation of IRF3. It was concluded that FAF1 plays a novel role in negatively regulating virus-induced IFNβ production and the antiviral response by inhibiting the translocation of active phosphorylated IRF3 from cytosol to nucleus. The second part demonstrates that FAF1 plays a role in cell motility and morphology by negatively regulating the RhoA signaling. RhoA is one of the Rho family small GTPases which regulates stress fiber formation and actin-myosin contractility, and subsequently mediates retraction of the trailing edge during cell migration. Silencing of FAF1 significantly induced RhoA activation, which led to increase stress fibers and focal adhesions. In order to investigate how FAF1 affects the RhoA activation, intrinsic nucleoside diphosphate (NDP) kinase activity of FAF1, newly found enzymatic activity, was examined in RhoA activation. FAF1 catalyzes the transfer of γ-phosphate of ATP to NDP by forming autophosphorylated intermediate at His160 as an active site and exhibits highest substrate specificity to GDP. NDP kinase defective mutant, H160A, strongly interacted with cytoskeletal proteins, actin and α-actinin-4, near plasma membrane and lost the inhibitory effect on RhoA. These findings implicate that NDP kinase activity of FAF1 is required to regulate RhoA activity and actin remodeling. Collectively, FAF1, a multi-domain containing protein, has various biological functions as heterogeneous complexes by interacting with various partners in different cellular structures. It is valuable strategies to regulate the immune response and cell motility by regulating the protein-protein interaction and enzymatic activity of FAF1. ;Fas-associated factor 1 (FAF1)은 UBXN family에 속하는 단백질로 여러 종류의 ubiquitin related domain을 가지고 있다. Ubiquitin-associated domain (UBA)과 ubiquitin-like 1,2 (UBL1, UBL2) domains 그리고 ubiquitin regulator X(UBX) domain을 가지고 있다. 이전 연구를 통해서 FAF1이 apoptosis, protein degradation 그리고 chaperone 단백질의 활성을 조절하는 등의 다양한 세포 내 기능을 수행하는 것이 밝혀졌다. 본 논문의 첫 번째 부분은 FAF1의 세포 내 포괄적인 기능을 밝히기 위해 계획되었다. Microarray 분석 결과 HeLa cell에 FAF1의 발현이 억제되면 antiviral response와 관련 된 interferon stimulated gene이 가장 크게 증가한 것을 확인하였다. 또한 세포 내 FAF1이 감소하면, Poly I:C와 respiratory syncytial virus (RSV)에 의한 type I interferons (IFNs)의 생성이 억제되는 것을 보았다. Interferon regulator factor 3 (IRF3)는 type I interferons (IFNs)의 생성을 조절하는 가장 중요한 전사 인자로 host innate immune response를 책임지고 있다. 본 연구에서는 FAF1과 IRF3가 각각 IPO5/importin-β3 와 직접 결합하는 것을 확인하였고, FAF1이 과발현 된 경우 IRF3와 IPO5의 결합이 감소하는 것을 관찰하였다. 이 결과는 FAF1이 IRF3가 핵으로 이동하는 것을 막아서 IRF3을 통한 IFNβ 합성을 저해함으로써 antiviral response를 억제한다는 것을 의미한다. 본인은 이 논문을 통해서 FAF1이 active phosphorylated IRF3가 세포질에서 핵으로 이동하는 것을 저해함으로써 virus에 의해 유도되는 IFNβ 생성을 억제하는 새로운 역할을 하고 있음을 밝혔다. 두 번째로, 이 논문을 통해서 FAF1이 RhoA signaling을 억제함으로써 cell motility와 morphology를 조절하는 역할을 한다는 것을 확인하였다. RhoA는 Rho family small GTPases 중의 하나로 stress fiber 형성과 actin-myosin contractility를 조절하여 cell migration 과정에서 cell의 trailing edge를 견인하는 역할을 담당한다. 세포 내에서 FAF1의 발현을 억제한 경우, RhoA의 활성이 크게 증가하였고, 이는 stress fiber 와 focal adhesion의 증가로 이어졌다. FAF1이 어떠한 기전으로 RhoA 의 활성을 조절하는지 연구하는 과정에서, FAF1이 nucleoside diphosphate (NDP) kinase activity라는 새로운 enzymatic activity를 가지고 있음을 확인하였다. FAF1은 ATP의 γ-phosphate가 NDP로 이동하는 반응을 촉진하였고, 그 과정에서 His-160이 autophosphorylation 되어 있는 intermediate을 만들었다. 이는 His-160이 NDP kinase 반응의 active site임을 의미한다. 또한 FAF1은 substrate중에서 GDP에 특이적으로 선택성을 보였다. NDP kinase 활성이 없는 FAF1 H160A mutant는 plasma membrane 근처에서 cytoskeletal protein인 actin과 α-actinin-4와 강하게 결합하였고, WT과 달리RhoA 활성을 저해하지 못하였다. 이 결과는 FAF1의 NDP kinase activity가 RhoA 활성과 actin remodeling을 조절하는 데 중요하다는 것을 의미한다. 종합하면, FAF1은 multi-domain을 가진 단백질로, 세포 내의 서로 다른 장소에서 다양한 종류의 complex를 만들어서 여러 가지 기능을 수행한다. 이 논문의 결과를 토대로, FAF1의 protein-protein 결합을 조절하거나, enzymatic activity를 조절하는 것은 immune response와 cell motility를 제어하는 중요한 방법이 될 것이다.