Role of cysteine oxidation in human H-ferritin ferroxidase activity

Abstract

Ferritin은 세포 내에서 잠재적으로 유해활성산소를 유발할 수 있는 2가 철 이온을 산화 및 수화시켜 ferritin 분자 내에 저장 및 운용하는 효소이다. 이 효소는 ferritin heavy chain (FTH)과 ferritin light chain (FTL)이라는 두 가지 분자를 다양한 조합으로 한 24개의 복합체로 이루어져 있다. 이 효소 기작에 대해서는 여러 방면으로 잘 연구되어 있지만 철 이온의 저장 및 운용의 조절에 관한 연구는 활발하지 않다. 인간의 ferritin H-chain은 세 개의 cysteine을 가지고 있는데, 그 중 Cys103와 Cys131는 포유류간에 매우 잘 보존되어 있으며, Cys91은 오직 인간에게만 존재한다. 본 논문에서는 Non-reducing SDS-PAGE 분석을 통해 다양한 암세포주와 재조합 ferritin heavy chain homopolymer에서 DTT의 환원 여부에 따른 gel 내의 분자 이동성에 변화를 관찰하였다. 이는 분자 내부에 reactive cysteine이 존재하여 이황화결합을 이루고 있음을 의미한다. DTT redox buffer solution을 이용하여 계산한 ferritin의 midpoint redox potential 값은 실제 ferritin이 세포내의 생물학적 산화환원 시스템에서도 그 산화-환원 상태의 변화가 일어날 수 있음을 보인다. 더 나아가 정제한 재조합 Ferritin WT과 cysteine mutant의 iron mineralization 활성을 유체흐름정지광학 분석을 통해 비교한 결과 cysteine mutants는 더 낮은 활성을 보임을 확인하였다. 더 나아가, 세포에 산화적 스트레스를 유발하였을 경우에도 세포마다 ferritin의 공기 중 산화 되는 형태가 다르게 나타나는 것을 관찰하였다. 이를 통해 ferritin의 내의 reactive cysteine의 존재와 효소활성에서의 그 중요성을 확인하였다. 세포 내에서 구조적 변화를 동반한 산화가 일어나 그 기능에 영향을 끼친다면, 세포내의 철 이온과 관련된 생명현상과 질병모델 연구에서 새로운 제안이 될 것으로 예상된다. ;Ferritin is an intracellular enzyme that catalyzes iron oxidation and hydration to store intracellular iron in ferritin cavity. It is a 24-heteropolymer composed of various combination with two types of subunit; ferritin heavy chain (FTH) and ferritin light chain (FTL). Although ferritin enzymatic mechanism has been studied well, its mechanism about regulation of iron uptake activity is still unclear. Human ferritin H-chain has three cysteine residues: Two, Cys103 and Cys131, are highly conserved among mammalian proteins and the other one, Cys91, present only in human protein. On non-reducing SDS-PAGE analysis of various cancer cell lysate and recombinant FTH, I observed the mobility shift of FTH band, implying the existence of an intramolecular disulfide linkage. The midpoint redox potential of recombinant ferritin heavy chain calculated by the DTT redox solution shows that its redox state is changeable in biological redox buffer system. Using stopped-flow spectrometer, iron mineralization of FTH WT and cysteine mutants are analyzed and the results showed the lower enzymatic activity of cysteine mutants compared to WT. Furthermore, in various cancer cell lines, I observed that different oxidation pattern of ferritin heavy chain in cellular stress conditions. Together, the data suggest that catalytic efficiency of FTH is regulated by redox states of cysteine residues and its activity could affect human cell viability and redox homeostasis.