Antitumor effects of Oldenlandia diffusa and a potential molecular target in Lung and Ovarian Cancer cells

Abstract

Cancer is one of the top causes of mortality globally. Cancer therapies have been significantly improved in recent years, yet most cancer patients still have a poor outcome. Alternative treatment such as traditional herbal medicine has been attracting research attention. Oldenlandia diffusa (Willd.) Roxb. (OD) has traditionally been used to cure lung and stomach cancer. Its molecular mechanism, however, has not been fully explored. The purpose of this study was to look into the anticancer properties of OD extract (EOD) and its standard substances, ursolic acid (UA; 3β-hydroxy-Urs-12-en-28-oic acid) and its isomer, oleanolic acid (OA; 3β-hydroxy-Olean-12-en-28-oic acid), and to predict a direct target in lung and ovarian cancer cells. OD extracts decreased cell viability in dose- dependent manners in lung cancer cells, A549 and H1299, and ovarian cancer cells, A2780. Both UA and OA also reduced cell viability in A549 and A2780 cells. When compared to the control group, cell viability was decreased in a dose-dependent manner and to less than 20% at a concentration of 40 μM of UA, and likewise was reduced by OA in a dose- dependent manner in both cells. Flow cytometry analysis with annexin-V antibody revealed that the cell death was associated with apoptosis in both A549 and A2780 cells. Additionally, treatments of UA and OA generated more Reactive Oxygen Species (ROS), with UA 80 μM creating 1.66 and 1.2-fold increases for A549 and A2780, respectively, and OA 120 μM creating 1.45 and 1.23-fold increases, although they have been reported to have antioxidant properties. Potential UA and OA targets were predicted in silico. Protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) was chosen as a top candidate with a greater than 90% probability for both UA and OA among the many anticipated targets from Swiss Target prediction. The HDOCK molecular docking simulations were carried out in the automated mode and yielded models for interaction complexes of UA and PTP1B. The models suggested interactions of UA with the side chains of some of its critical residues; 1) Glu276, 2) Thr154 and Arg156, or 3) Thr154, Thr177, and Gln123. Analysis of cancer database revealed that the PTP1B-encoding gene, PTPN1, were genetically and transcriptionally associated with cancer. Genetic alteration of the PTPN1 gene was largely limited to amplification, which were associated with relatively higher mRNA expression in lung and ovarian cancers. Moreover, patients with increased PTPN1 expression levels had considerably worse overall survival in both cancer types. Although siRNA-mediated knockdown of PTP1B unexpectedly did not show significant influence on cell viability, further investigation is required to conclude a role of PTP1B on cell proliferation using complete depletion of PTP1B. Taken together, these data suggests that EOD effectively induced cell death in lung and ovarian cancer cells, possibly by targeting PTP1B, of which expression was associated with poor diagnosis. To validate the suggested molecular target, further investigation is required to test the inhibitory effect of PTP1B activity upon EOD, UA, and OA treatment and the induction of cell death by PTP1B inhibition. In addition, the relationship between PTP1B inhibition and ROS induction upon EOD, UA, and OA treatment should be elucidated.;암은 세포 주기와 사멸이 조절되지 않아 세포 증식이 지속하는 특징을 갖는 질환으로, 다양한 치료법의 발달에도 불구하고 전 세계적으로 주요 사망 원인 중 하나이다. 주요 치료법으로 활용되는 화학적 항암 요법은 부작용이 높고 내성을 일으킬 수 있어, 이를 보조할 수 있는 대체 치료법 혹은 병행치료법에 대한 연구의 필요성이 부각되어 왔다. 백화사설초는 전통 의료에서 항 염이나 진통을 목적으로 활용되어 온 약재이며, 위암과 폐암 치료에도 활용된 기록이 있다. 최근 세포 모델을 활용하여 백화 사설 초의 항암 효과를 보인 연구도 발표된 바 있으나 이 효능과 관련된 분자적 기전 연구는 매우 부족하다. 따라서 본 연구는 폐암 세포와 난소암 세포 모델을 이용하여 백화사설초 추출물과 이 추출물에 다량 포함된 표준 물질인 우르솔산(UA; 3μ-hydroxy-Urs-12-en-28-oic acid)과 올레놀산(OA; 3μ-hydroxy-Olean-12-en-28-oic acid)의 분자적 표적을 탐구하는 데 목적을 두었다. 백화사설초추출물은 폐암 세포인 A549 와 H1299 와 난소암 세포인 A2780 과 SK-OV-3 에서 농도가 증가함에 따라 유의적으로 세포 생존율을 감소 시켰다. 우르솔산과 올레놀산을 처리하였을 때도 처리 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 유의적으로 줄어들었다. 이 세포 생존율의 감소가 세포 사멸 효과와 관련이 있는지 알아보기 위해 유세포 분석기를 활용한 annexin-v 항체 기반 분석을 하였다. 우르솔산과 올레놀산은 두 세포 모델 모두에서 세포 사멸을 유도하였다. 암세포의 세포 사멸은 세포 내 활성산소종의 증가와 관련이 있다고 알려져 있으나, 우르솔산과 올레놀산의 항산화 기능이 보고된 바 있어, 세포 내 활성산소종의 정도를 측정하였다. 우르솔산과 올레놀산의 처리는 세포 내 활성산소종을 유의하게 증가시켰으며, 우르솔산 80μM 은 A549 와 A2780 세포에서 각각 1.66 배와 1.2 배, 올레놀산 120μM 은 1.45 배, 1.23 배씩 증가시켰다. 다음으로 백화사설초추출물의 분자적 표적 발굴을 위해 우르솔산과 올레놀산의 잠재적인 표적을 in silico 로 예측하였다. 두 triterpenoid 에 대해 Swiss target prediction 에서 예상하는 표적 중 PTP1B 가 가장 높은 확률(90% 이상)로 예측되었으며, 이 상호작용을 확인하기 위하여 자동화 모드를 기반으로 하는 HDOCK 을 이용하여 분자 도킹 시뮬레이션을 수행했다. 우르솔산과 PTP1B 의 상호작용 복합체에 대한 모델을 산출한 결과, 1) Glu276, 2) Thr154 및 Arg156, 3) Thr154, Thr177, Gln123 과의 결합 상호작용이 예측되었다. 발굴된 결합 예상 아미노산 잔기들은 PTP1B 효소 활성에 중요하거나 진화적으로 보존된 것으로 보고된 바 있어, 우르솔산이 상호작용을 통해 PTP1B 의 효소작용을 방해할 가능성을 제시하였다. PTP1B 가 암의 병리적 기전과 관련이 있는지 확인하기 위해 TCGA 기반 암 데이터베이스를 분석한 결과, PTP1B 를 암호화하는 유전자인 PTPN1 이 유전적으로 전사적으로 암과 관련이 있었다. 유전자의 구조적 변형은 최대 8%의 제한된 환자에게서만 발견되었으나, 주로 증폭(amplification) 이 발견되었으며, PTPN1 이 증폭된 환자들에게서 상대적으로 mRNA 발현이 높은 것을 확인하였다. 더욱이 PTPN1 의 유전자 발현 수준이 증가한 환자들은 두 암 유형 모두에서 전반적인 생존율이 유의적으로 더 낮았다. 비록 siRNA 를 통한 PTPN1 의 유전자 발현을 억제하였을 때 세포 생존 가능성에 큰 영향을 미치지는 않았지만, 이후에 단백질 수준에서 억제가 되었을 때도 세포 생존에 영향을 미치지 않는지 확인이 필요하다. 결과를 종합하면, 우르솔산과 올레놀산을 함유한 백화사설초추출물은 폐암과 난소암에서 암세포의 사멸을 유도하는 데 효과적이며, PTP1B 가 항암 기작의 분자적 표적으로 발굴되었다. 차후에 제안된 분자적 표적을 검증하기 위해 백화사설초추출물, 우르솔산과 올레놀산 처리 시 PTP1B 역가 측정, PTP1B 억제 시 세포사멸 효과와 PTP1B 억제와 ROS 증가의 연관성 분석 등에 관한 추가 분석이 필요하다고 사료된다.