Development of Metabolically Engineered Microorganisms for the Biosynthesis of Polyhydroxyalkanoates Containing 4-Hydroxyvalerate and 3-Hydroxyhexanoate Monomers

Abstract

Metabolic engineering strategies towards to incorporate various monomers for enhancement of physical and mechanical properties of PHAs have been developed in many years. In this study, biosynthesis of PHAs using which containing 4-hydroxyvalerate (4-HV) and 3-hydroxyhexanoate (3-HHx) as a monomer by metabolic engineering was examined with microorganisms. For biosynthesis of 4-HV-containing PHAs from levulinic acid, 4-HV-CoA was produced by the expression of Pseudomonas putida KT2440 lvaE and lvaD genes in microorganisms. In case of the production of 3-HHx-containing PHAs using glucose as a sole carbon source, condensation of acetyl-CoA and butyryl-CoA is important branch node of formation of C6 monomers. Therefore, butyryl-CoA produced by the overexpression of Clostridium acetobutylicum hbd, crt and Treponema denticola ter genes and condensation with ß-ketothiolase. Finally, screening of PHA synthases was conducted to for the efficient production of 4-HV and 3-HHx-containing PHAs with the 5-20 mol% monomer mol fraction. This is the first report on the production of 4-HV and 3-HHx-containing PHAs by metabolically engineered E. coli and R. eutropha using levulinic acid and glucose as a carbon source respectively.;최근 기후 변화와 더불어 석유 자원의 고갈, 폐 플라스틱 문제 등을 해소하기 위해 바이오 매스 등 재생 가능한 자원으로부터 고부가가치 화합물을 탄소 중립적인 방식으로 생산할 수 있는 바이오리파이너리가 주목받고 있다. Polyhydroxyalkanoates (PHAs)는 생분해성 고분자로, 생합성이 가능하고 자연에서 분해 가능하여 기존 플라스틱의 대체제로서 각광받고있다. PHAs에 다양한 단량체를 중합시키면 그 물성이 poly(3-hydroxybutyrate)보다 개선되는데, 이러한 PHAs를 생산하기 위해 많은 대사 공학 전략을 통한 균주 개발이 이루어지고 있다. 본 연구에서는 4-hydorxyvalerate (4-HV)와 3-hydroxyhexanoate (3-HHx) 단량체를 포함하는 PHAs를 5-20 mol%로 생산하는 것을 목표로 하였다. 레불린산을 기질로 하여 4-HV를 포함하는 PHAs 생합성하는 과정에서 Pseudomonas putida KT2440의 lvaE와 lvaD 유전자들을 미생물에서 발현시켜 4-HV-CoA를 생성하여 고분자에 중합시겼다. 3-HHx 단량체는 포도당을 단일 탄소원으로 하여 이 단량체를 만들기 위한 대사 회로를 구축하였다. 이 대사 회로에서 C6 단량체의 생성을 위해서는 acetyl-CoA와 butyryl-CoA의 중합이 중요하다. 따라서 Clostridium acetobutylicum 의 hbd, crt 유전자와 Treponema denticola 의 ter 유전자를 발현시켜 butyryl-CoA 생성량을 늘리고, actyl-CoA와 ß-ketothiolase로 축합반응으로 C6 단량체를 생성하였다. 마지막으로, 생성된 4-HV와 3-HHx를 5-15 mol%의 몰분율을 목표로 하여 효율적으로 중합하기 위하여 다양한 PHA synthase들을 스크리닝 하였다. 본 연구는 E. coli와 R. eutropha 균주에서 레불린산을 기질로 하여 4-HV 단량체를 포함하는 PHAs를, 포도당을 단일 탄소원으로 하여 3-HHx 단량체를 포함하는 PHAs를 처음으로 만들어 보고하였다.