Carbonic anhydrase 9 regulates anoikis resistance and tumor metastasis in triple-negative breast cancer

Abstract

Anoikis is a type of apoptosis caused by cell detachment form extracellular matrix (ECM) and normal epithelial cells are sensitive to anoikis upon cell detachment. However, cancer cells become resistant to anoikis and they survive during circulation although they lose attachment to ECM. Therefore, acquisition of anoikis-resistance is essential to cancer cells for successful cancer metastasis and thus anoikis sensitization is a potential strategy to prevent cancer metastasis. Previously, using 4T1, CTC1 and CTC2 mouse metastatic breast cancer cells we found that carbonic anhydrase 9 (CA9) is upregulated when cells lose their adhesion by RNA seq analysis. Here, I investigated the role of CA9 in anoikis regulation using CTC1 and human metastatic breast cancer MDA-MA-231 cells. In suspension culture, when compared with attached culture, CA9 is upregulated at both mRNA and protein levels in 4T1, MDA-MA-231 cells, and in more aggressive CTC1 cells which are derivative from 4T1. Knockdown of CA9 using its si-RNA (si-CA9) increased cell death of both attached and suspended cells in all three cell lines. Treatment of si-CA9 also decreased metastatic characteristics such as cell migration, invasion, and growth in 3D culture condition. In addition, when si-CA9-treated cells were xenografted either orthotopically or via tail vein of mice, tumor growth and lung metastasis were inhibited and thus survival of the mice increased in vivo. Mechanistically, the CA9 knockdown decreased IGF-1R expression and phosphorylation of both IGF-1R and Src, which are critical to the anoikis resistance. Knockdown of IGF-1R decreased CA9 expression and Src phosphorylation, and increased anoikis. Taken together, these data suggest that CA9 plays an important role in anoikis resistance and cancer metastasis of TNBC cells by regulating the IGF-1R/Src signaling pathway and that CA9 is a potential target for the treatment of TNBC. ;세포가 세포외기질(ECM)로부터 떨어졌을 때 발생하는 세포 사멸의 한 종류인 anoikis에 저항성을 갖는 것은 암 전이에 매우 중요하며, 암 전이는 암으로 인한 사망의 주요 원인이기 때문에, 암 세포가 anoikis에 민감해지도록 하는 것은 전이를 예방하는 전략이 될 수 있다. 따라서, 부착성이 없는 현탁(suspended) 조건에서 암 세포를 배양했을 때, 발현이 증가하는 유전자가 anoikis 저항성에 중요할 수 있다. 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포를 사용한 RNA 서열 분석 데이터를 사용해, 현탁 조건에서 증가하는 유전자 중, 유방암에서 좋지 않은 예후를 보이는 탄산 탈수 효소 9(CA9)의 역할을 이번 연구를 통해 밝히고자 한다. TNBC 세포를 현탁 조건에서 배양했을 때, CA9의 mRNA 및 단백질 발현 은 증가했다. 또한, si-RNA를 사용하여 CA9의 발현을 감소시키면 세포의 응집 정도와 세포 성장은 감소하였고 anoikis는 증가했으며, 이동성(migration), 침윤성(invasion) 그리고 3차원 세포 성장과 같은 전이 특성을 감소시켰다. 또한, CA9의 발현을 감소시킨 세포를 쥐에 주입했을 때, 쥐에서 폐 전이가 감소되고 쥐의 생존율은 증가했다. CA9의 발현을 감소시키면 anoikis 저항성 획득에 중요한 IGF-1R, Src의 활성화가 감소했다. 반대로, IGF-1R의 억제는 CA9의 발현과 Src의 활성화를 감소시켰다. 따라서, CA9이 IGF-1R 및 Src 단백질과 상호작용을 하는지에 대한 여부와 그 방법에 대한 추가 연구가 필요하지만, 이 연구을 통해 CA9이 IGF-1R 및 Src 단백질을 조절하여 anoikis 저항성과 암 전이에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 종합해보면, CA9이 TNBC에서 anoikis 저항성 및 전이의 잠재적인 표적이 될 수 있음을 시사한다.