Identifying downstream target genes of TAp63α under DNA damage using inducible stable cell lines by T-REX system

Abstract

TAp63α is homologue of p53 protein family and is expressed in post-meiotic recombination immature dictyate-stage oocytes. Dictyate-stage oocytes are intensively sensitive to very low levels of DNA damage and they express increased amount of TAp63α when their DNA damage sensitivity arises. DNA damage induces TAp63α phosphorylation thus activates pro apoptotic genes transcription. We previously stated that TAp63α phosphorylation is regulated by a positive autofeedback regulatory loop. Mutants of TAp63α of variable transcriptional strength show varying levels of phosphorylation induction after DNA damage. Transcriptionally inactive mutants show no DNA damage-induced phosphorylation while transcriptional more active TAp63α variants show greater tendency for phosphorylation induction upon high overexpression even without DNA damage. Although current studies have mainly focused on kinases mediating TAp63α phosphorylation, results show phosphatase inhibition alone without DNA damage induces high levels of TAp63α phosphorylation, suggesting phosphatase regulation may be an important determinant of TAp63α phosphorylation. We hypothesize that kinase activity may be constitutively on and/or constitutively suppressed by phosphatase activity in undamaged cells, and the balance of kinase-phosphatase activity together regulates TAp63α phosphorylation. The kinase-phosphatase equilibrium may be shifted towards greater kinase activity indirectly by TAp63α transcriptional activity mediating possibly phosphatase inhibition. In this study, I sought to distinguish the downstream target genes possibly have involvement in the regulation of TAp63α phosphorylation, by analyzing mRNA sequencing data between WT TAp63α and transcriptionally inactive mutant of TAp63α. Apart from genes regulating interestingly Wnt signaling pathway and Caspases involved with cell death, differences in a number of kinase and phosphatase genes appeared. Most interestingly, and perhaps most unexpectedly, TAp63α transcribes high expression of small RNAs, including U11 and U12, which are part of minor spliceosome complex activating alternative splicing mechanism. A search with Genehancer suggests a relationship between U11 and PPP1R8 (NIPP-1) PP1 phosphatase inhibitor, that may be involved with regulating TAp63α phosphorylation.;p53의 종양 억제 인자 패밀리의 구성원 인 p63 이소 형 TAp63α는 감수 분열 후 재조합 미성숙 dictyate 단계 난 모세포에서 고도로 발현됩니다. Dictyate 단계 난 모세포는 매우 낮은 수준의 DNA 손상에 매우 민감합니다. dictyate 단계 난 모세포에서 TAp63α 발현 수준은 발달 과정에서 난 모세포의 DNA 손상 감도 증가와 타이밍이 일치합니다. DNA 손상은 TAp63α 인산화 및 세포 사멸 유도 유전자의 전사 활성화를 유도합니다. 우리의 연구에 따르면 TAp63α 인산화 유도 자체는 긍정적 인 자동 피드백 조절 루프에 의해 조절됩니다. 다양한 전사 강도의 TAp63α 돌연변이 체는 DNA 손상 후 다양한 수준의 인산화 유도를 나타냅니다. 전사 불활성 돌연변이 체는 DNA 손상 유발 인산화를 나타내지 않는 반면 전사 활성 TAp63a 변이체는 DNA 손상 없이도 높은 과발현시 인산화 유도에 대한 더 큰 경향을 보여줍니다. 현재의 연구는 주로 TAp63α 인산화를 매개하는 키나제에 초점을 맞추고 있지만, 결과는 DNA 손상없이 포스파타제 억제만으로 높은 수준의 TAp63α 인산화를 유도하여 포스파타제 조절이 TAp63α 인산화의 중요한 결정 요인이 될 수 있음을 보여줍니다. 우리는 키나제 활성이 손상되지 않은 세포에서 포스파타제 활성에 의해 구성 적으로 및 / 또는 구성 적으로 억제 될 수 있으며 키나제-인산 분해 효소 활성의 균형이 함께 TAp63α 인산화를 조절한다고 가정합니다. 키나제-포스파타제 평형은 가능한 포스파타제 억제를 매개하는 TAp63α 전사 활성에 의해 간접적으로 더 큰 키나제 활성으로 이동 될 수있다. 이 연구에서는 WT TAp63α와 TAp63α의 전사 비활성 돌연변이 사이의 mRNA 염기 서열 데이터를 분석하여 TAp63α 인산화 조절에 관여 할 수있는 하류 표적 유전자를 구별하고자했습니다. 흥미롭게도 Wnt 신호 전달 경로를 조절하는 유전자와 세포 사멸과 관련된 Caspases와는 별도로, 키나아제와 포스 파타 아제 유전자의 차이가 나타났습니다. 가장 흥미롭게도, 아마도 가장 예기치 않게, TAp63α는 대체 스 플라이 싱 메커니즘을 활성화하는 마이너 스플 라이스 오솜 복합체의 일부인 U11 및 U12를 포함한 작은 RNA의 높은 발현을 전사합니다. Genehancer를 사용한 검색은 TAp63α 인산화 조절에 관여 할 수있는 U11과 PPP1R8 (NIPP-1) PP1 포스파타제 억제제 사이의 관계를 시사합니다.