Analysis of Intact Glycopeptide in Erythropoietin for Doping Control using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Abstract

Recombinant EPO, a representative glycoprotein hormone designated by the World Anti-Doping Agency as a prohibited drug, has been misused and abused to improve athletic performance in sports. This protein has a glycan structure of a tetra-sialic acid, unlike endogenous EPO. In this study, we aimed to identify this structure in a recombinant EPO using the Biological Reference Preparation for erythropoietin (BRP) as a working standard. Thus, in order to analyze the recombinant EPO, a LC–MS method using a glycopeptide enrichment technique on the intact recombinant EPO glycopeptide was established. The glycan structure of the tetra-sialic acid found only in the recombinant EPO was obtained using the PMi software and a high score and high repeatability peak from this candidate group was selected as a target for detecting recombinant EPO. In addition, a detection experiment was performed in urine samples through the optimization process of the recombinant EPO detection assay. Additionally, an ELISA method was used for the detection of EPO in urine samples. By optimizing the analysis method, the experimental time was reduced to less than one day, and the process of distinguishing recombinant EPO from endogenous EPO was more efficiently and less time consuming. In this study, we were able to analyze an intact glycopeptide with a tetra-sialic acid glycan structure present only in recombinant EPO through an LC–MS analysis. This rapid assay allows an effective detection of recombinant EPO, a prohibited substance in sport competitions.;재조합 EPO는 대표적인 당 단백질 호르몬으로, 스포츠에서의 운동능력 향상을 위해 오용 및 남용되면서, 세계 반 도핑 기구에서 재조합 EPO를 금지약물로 지정했다. 금지약물로 지정된 재조합 EPO에는 내인성 EPO와는 달리 tetra-시알산의 글리칸 구조가 있고, 도핑 금지약물로 지정된 재조합 EPO, 그중에서도 Biological Reference Preparation for erythropoietin (BRP)에서 이런 특이적 구조를 확인하고자 했다. 본 실험에서는 재조합 EPO를 트립신 효소반응 시킨 후 glycopeptide enrichment 기법을 사용하여 전처리하고, LC-MS를 통해 재조합 EPO의 intact 한 glycopeptide를 분석했다. 분석 결과는 PMi 소프트웨어를 사용해 재조합 EPO에서만 발견되는 tetra-시알산의 글리칸 구조를 가진 특이적 peak의 후보군을 얻고, 이 후보군에서 높은 점수와 반복성이 높은 피크를 재조합 EPO 검출 target으로 선정했다. 또한 재조합 EPO 검출 분석 법의 최적화 과정을 거쳐 재조합 EPO를 실제 소변 시료에 적용시켜 검출 실험을 수행했다. 실제 소변 시료에서 검출을 위해 ELISA 방법을 사용했으며, 분석방법의 최적화를 통해 실험 시간을 하루 미만으로 줄임으로써 보다 효율적으로 빠른 시간 안에 재조합 EPO와 내인성 EPO를 구분할 수 있는 피크를 분석할 수 있었다. 본 연구 결과, LC-MS 분석을 통해 재조합 EPO에만 존재하는 tetra-시알산 글리칸 구조를 가진 intact 한 glycopeptide를 분석할 수 있었으며, 해당 분석 법은 스포츠 경기에서 금지약물로 지정되어 있는 재조합 EPO를 빠른 시간 내에 검출하는 데 사용할 수 있을 것으로 예측되었다.