Potential upstream regulatory factors of AlkB homolog 5 (ALKBH5) for multipotent stem cell differentiation

Abstract

Multipotent stem cells have the potential for myogenic, adipogenic, osteogenic, and chondrogenic differentiation. Due to their broad developmental potential, stem cell research is helpful for understanding human development and disease. Differentiation of stem cells is a highly orchestrated process regulated by differentiation-specific transcriptional factors and extrinsic factors such as microenvironment. It has emerged that epigenetic regulation is another key component for regulation of cell differentiation. Epigenetic regulation depends on chemical modifications on nucleic acids and histone proteins. N6-methyladenosine (m6A), the most abundant mRNA modification in eukaryotes, plays an important role in cell differentiation through regulating RNA metabolism including pre-mRNA splicing, 3’-end processing, regulation of translation, and mRNA decay. Recent studies have demonstrated that the fat mass and obesity-associated (FTO), the first identified m6A demethylase, was strongly associated with obesity and adipogenesis. Another m6A eraser, AlkB Homolog 5 (ALKBH5), was reported to promote cancer stem cell specification, proliferation, and tumorigenesis, and our preliminary study showed its deficiency led to hindered myogenic differentiation. However, little is known how ALKBH5 is involved in cell differentiation and what kind of upstream factors might regulate ALKBH5 to induce cell differentiation. Here, we demonstrate ALKBH5, an m6A demethylase, as a key regulator in cell differentiation and identify molecular mechanisms of ALKBH5-mediated cell differentiation using C2C12 myogenic cell model. Firstly, we found that the length and width of myotubes increased upon ALKBH5 overexpression (p<0.005). However, siRNA-mediated Alkbh5 knockdown significantly decreased myotube length and width (p<0.001). For investigating how ALKBH5 regulates cell differentiation, we focused on post-transcription regulation via miRNAs because there were no validated transcriptional factors regulating Alkbh5. Through in silico analysis, we selected miR-455-3p as a potential miRNA targeting Alkbh5 gene. Indeed, ectopic overexpression of miR-455-3p down-regulated Alkbh5 gene expression by 21.8% (p<0.05) and led to a decrease in myotube length and width by 54.4% and 40.9%, respectively. However, ALKBH5 overexpression compensated miR-455-3p-induced myogenesis suppression (p<0.005). As C2C12 cells have the capacity to trans-differentiate into adipocyte, we investigated the role of ALKBH5 in C2C12 trans-differentiation towards adipocyte. ALKBH5 overexpression facilitates lipid formation (p<0.05), however, Alkbh5 knockdown reduced lipid droplets (p<0.05). We conducted Gene set enrichment analysis to reveal biological pathways involved in C2C12 trans-differentiation and found out hypoxia pathway as a potential regulatory factor for adipogenesis in C2C12 cells. With two hypoxia-mimicking agents, Alkbh5 gene expression was significantly up-regulated after 12hrs treatment (p<0.005), which implies that hypoxia pathway may participate in cell differentiation via Alkbh5 regulation. Collectively, our results propose novel upstream mechanisms of ALKBH5 and highlight the important role of ALKBH5 in cell differentiation.;다분화능 줄기세포(Multipotent stem cell)는 근육세포, 지방세포, 골세포, 연골 세포와 같은 여러 가지 유형의 세포로 분화가 가능한 세포를 말하며, 인체의 발달과 질병을 이해하는 데 있어 중요한 모델로 사용되고 있다. 세포의 분화 과정은 세포 내 유전자 발현을 조절하는 주요 전사인자와 세포 외 미세환경 변화에 의해 조절된다고 알려져 있으며, 최근에는 후성유전적 변형 또한 주요한 조절인자로 인지되고 있다. 후성유전적 조절은 유전자 염기서열의 변화없이 핵산과 히스톤 단백질에 붙는 화학적 변형들의 변화를 통해 일어나며, DNA 뿐 아니라 RNA의 변형의 생물학적 의미에 대해서도 최근 활발한 연구가 진행되고 있다. N6-methyladenosine (m6A)는 진핵생물에서 가장 많이 발견되는 mRNA 변형으로, RNA 스플라이싱, 전사 가공, 번역 과정 조절, 붕괴 등 RNA 대사에 관여함으로써 유전자 발현을 조절하는 후성유전적 기전이다. m6A 탈메틸화 효소로 처음 발견된 Fat mass and obesity-associated (FTO)는 비만과 높은 연관성을 보이며, 지방 분화를 촉진한다고 알려져 있다. 또다른 m6A 탈메틸화 효소인 AlkB Homolog 5 (ALKBH5)는 암 줄기세포의 계통 특이성(specification), 세포 증식, 종양형성을 촉진한다고 알려져 있다. 본 연구실의 선행 연구에서는 ALKBH5결핍이 근육분화를 지연시킬 수 있다는 것을 보고하였으나, 그 조절 기전이나 상위조절인자는 아직 밝혀지지 않았다. 따라서, 본 연구는 C2C12 myogenic세포 모델을 통해 m6A 탈메틸화 효소인 ALKBH5가 세포 분화에 핵심 조절인자임을 밝히고, ALKBH5의 상위조절 기전을 규명하고자 하였다. 먼저, myotube의 길이와 너비는 ALKBH5 과발현에 따라 증가하고(p<0.005), Alkbh5 억제에 따라 감소함을 확인하였다(p<0.001). 다음으로, ALKBH5를 조절하는 상위 기전을 밝히기 위해, in silico 분석을 통해 Alkbh5를 타겟할 것이라 예상되는 miRNA로 miR-455-3p를 선정했다. miR-455-3p는 Alkbh5의 발현을 21.8% 낮추고(p<0.05), myotube의 길이와 너비를 각각 54.4%, 40.9% 감소시켰다. 하지만, ALKBH5 과발현은 miR-455-3p에 의한 근육 분화 억제 현상을 회복시켰다(p<0.005). 한편, C2C12 세포는 지방세포로 전환분화(trans-differentiation) 할 수 있는 세포이므로, ALKBH5 가 C2C12 세포의 지방 분화에 미치는 역할도 함께 살펴보았다. ALKBH5 과발현은 지방 형성을 촉진시켰으나(p<0.05), Alkbh5 억제는 유의적으로 지방구를 감소시켰다 (p<0.05). 지방 전환분화에 관여하는 생물학적 경로를 찾기 위해 Gene set enrichment analysis (GSEA)를 진행하였고, Hypoxia 경로를 도출하였다. Hypoxia 모방 물질을 세포에 12시간 처리하였을 때 Alkbh5 유전자 발현이 증가되었는데(p<0.005), 이는 hypoxia 조건에서 증가한 ALKBH5가 세포 분화에 관여할 수 있음을 시사한다. 본 연구결과는 ALKBH5가 근육 분화와 지방 전환분화 모두에 중요한 요소임을 밝혔고, ALKBH5에 의한 세포 분화 조절의 상위 기전을 새롭게 제안하였다는 것에 의의가 있다.