Examination of Nutrient Limitation Condition for High-level Production of Polyhydroxyalkanaotes (PHAs) by Methylosinus trichosporium OB3b

Abstract

Development of sustainable process for the production of biodegradable plastics from renewable resources is one of the principal challenges of current environmental crisis such as climate change and plastic pollution. In this regards, production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) from various renewable feedstocks is of interest since they are naturally occurring biodegradable polyesters in various bacteria. Methylosinus trichosporium OB3b, the type II methanotroph, can naturally produce poly(3-hydroxybutyrate) [P(3HB)] from methane that is abundantly found in natural and greenhouse gas, thus providing beneficial effects on environment in two aspects: (i) a breakaway from petroleum-based process and (ii) greenhouse gas reduction. Here, optimization of culture conditions on nutrient limitation on P(3HB) production and its scale-up using M. trichosporium OB3b have been studied. First, various gas ratios of methane and oxygen were examined in order to determine the optimal flask cultivation condition for P(3HB) production, where 1:1 ratio of methane to oxygen supported the highest production of P(3HB) with final concentration and content of 1.01 g/L and 45.11 wt%, respectively, in flask cultivation. Second, limitation effect of process optimization factors such as nitrogen, sulfur and copper sources in culture medium was investigated for the enhanced production of P(3HB). Among them, sulfur limitation was appeared to be the most effective for P(3HB) production, resulting in 1.81 g/L of P(3HB) with the content of 62 wt%. The optimized culture condition was further applied to the productions of other PHA members such as poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxypropionate) [P(3HB-co-3HP)] and could support enhanced productions of P(3HB-co-3HP). Next, sulfur content required for supporting cell growth was investigated using an elemental analyzer in order to tightly control the sulfur limitation condition in further scale-up productions of PHAs and was determined as 0.37 wt% of total cell dry mass. Then applying sulfur limitation condition at cell concentrations of 1 g/L enhanced the cell content to 74.22 wt% in scale-up 3 L bioreactor. Furthermore, in scale-up 5 L bioreactor, the P(3HB) content was identified up to 54.89 wt% by applying an sulfur limitation at 2.5 g/L cell concentrations.;지속가능한 삶을 위해 재생 가능한 자원으로부터 바이오화학 물질 생산 연구는 기후 변화와 폐플라스틱과 같은 환경 위기에 맞서기 위해 활발히 이루어지고 있다. 다양한 생분해성 중 polyhydroxyalkanoates (PHAs)는 재생 가능한 연료로부터 다양한 박테리아에서 자연적으로 생산될 수 있기에 가장 큰 관심을 받는 바이오 생분해성 폴리에스테르이다. 메탄자화균 타입 2인 Methylosinus trichosporium OB3b는 천연가스와 온실 가스의 높은 구성 성분인 메탄을 탄소원으로 이용하여 자연적으로 PHA 종류 중 하나인 polyhydroxybutyrate(PHB)를 생산할 수 있다. 따라서 M. trichosporium OB3b 균주를 생분해성 바이오물질 생산에 이용함으로서 석유 기반 공정에서의 이탈과 온실 가스 감소라는 두 가지 측면에서 환경에 긍정적인 효과를 일으킬 수 있다. 본 연구에서는 영양성분을 배지로부터 제한하여 M. trichosporium OB3b로부터 PHB의 셀 축적량과 생산량을 증가시키고자 하였다. 먼저 플라스크 수준에서 최적의 실험 조건을 확보하고자 메탄과 산소의 공급량을 확인하였다. 플라스크 배양에서 메탄과 산소의 비율을 1:1로 조절하여 1.01 g/L와 45.11 wt%의 P(3HB)를 생산하였다. 두 번째로, P(3HB) 셀 축적량을 향상시키기 위해 배양 NMS 배지에서 M. trichosporium OB3b 영양 성분인 질소, 황, 구리를 제한하여 배지 최적화를 진행하였다. 그 중 황 성분 제한이 P(3HB) 생산에 가장 효과적으로 나타났으며, 결과적으로 1.81 g/L와 62 wt %의 P(3HB)를 생산했다. 이 때, 추가적으로 최적화한 1:1의 메탄과 산소 비율과 질소와 황 배지 제한 조건을 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxypropionate) [P(3HB-co-3HP)]와 같은 다른 종류의 PHA 생산에도 적용해보고자 했다. P(3HB-co-3HP)와 같은 코폴리머 생산에서도 최적화한 배양 조건에서 더 높은 생산량을 확인할 수 있었다. 이로써 OB3b 균주 조작을 통해 다른 물질을 생산함에 있어서도 최적화된 배양 조건의 적용 가능성을 확인하였다. 플라스크 배양에서의 어려움의 극복과 M. trichosporium OB3b로부터 P(3HB) 생산의 산업화에 다가가기 위해 황 제한 배지 배양 조건을 스케일업하여 3 L와 5 L 발효기에 적용하였다. 먼저 황 제한 조건을 자동적으로 적용하기 위해 원소분석기를 이용하여 M. trichosporium OB3b의 황 함량을 0.37 wt%로 확인하였다. 3 L의 발효기에서 1 g/L의 셀 농도에서 황 제한을 적용하여 P(3HB)의 셀 축적량을 74.22 wt%로 높였다. 나아가 5 L 발효기에서 2.5 g/L의 셀 농도에서 황 제한을 적용하여 54.89 wt%의 P(3HB) 셀 축적량을 확인했다. 본 연구를 통해 M. trichosporium OB3b의 영양 성분 제한을 통해 P(3HB) 생산량을 증대시킬 수 있음을 확인하였다. 질소와 황의 제한 비율과 제한 적용 시점에 대한 추가적인 연구가 이루어져 완벽한 제한 배지 최적화가 이루어질 필요가 있다. 또한 M. trichosporium OB3b의 균주 조작을 통해 더 다양한 바이오화학물질 생산 연구가 이루어지고, 이 과정에 최적화한 배양 조건이 더해지면 저렴하고, 온실가스의 주요 원인인 메탄 가스를 이용하여 석유 기반 물질을 대체할 수 있는 생분해성 바이오물질의 대량 생산이 가능할 것이다.