Chelidonium majus L. Extracts-induced Cell Death in Ovarian Cancer Cells through DNA Damage Response Pathway

Abstract

Acquired chemotherapy resistance is a major obstacle to treatment for ovarian cancer. To reduce the resistance, traditional herbal products containing bioactive compounds have been considered as an important complementary strategy. Chelidonium majus L, containing isoquinoline alkaloids, has been used for anti-inflammatory, anti-viral, and anti-cancer effects in traditional oriental therapy. We aimed to investigate the effects of C. majus L. extract on cell proliferation of ovarian cancer cells and its underlying molecular mechanism. C. majus L. extract treatment reduced cell viability in a dose-dependent manner in ovarian cancer cells, including cisplatin resistance cell lines. It induced apoptosis, shown by increased BAX expression and annexin V staining. However, cisplatin and C. majus L. extract combination have no synergic effects on ovarian cancer. In C. majus L. extract treatment activated the DNA damage response (DDR), indicated by upregulation of GADD45A and P21 expression in both types of cells regardless of sensitivity to C. majus L. extract, while reduced CCNB1 expression in only A2780, a cell line that was relatively responding to C. majus L. extract. Moreover, the siRNA-mediated GADD45A knockdown confirmed that GADD45A played a role in C. majus L. extract-induced apoptosis. To understand the mechanism of the effect, the gene enrichment analysis (GSEA) of microarray data from multiple ovarian cancer cells was conducted by dividing into two groups according to the sensitivity to the C. majus L. extract treatment. The analysis revealed that one of the major differentially expressed pathways was the MYC target pathway. MYC target pathway was expressed significantly higher in the response cell lines against C. majus L. extract than the less response cell lines. SKOV3, a cell line that was relatively less responding, became sensitive to C. majus L. extract treatment upon MYC overexpression through HR deficiency. The results together demonstrated that MYC was critical for cytotoxicity of C. majus L. extract treatment in ovarian cancer cells and C. majus L. extract led to cell death by switching on DDRs. In this study, we revealed that DNA damage reaction was involved in the treatment of C. majus L. extract. However, there are limitations of not showing a clear target of the components of the extract and experiments were conducted in vitro. Nevertheless, the results are meaningful to clarify the mechanism of anticancer effect of ovarian cancer of C. majus L. extract, and to propose a subtype of cells with high sensitivity to this effect. ;재발과 항암제 내성 등과 같은 문제가 난소암치료에 장애물이 되고 있으며 이에 따라 저항성을 줄이기 위해 생리 활성 화합물을 포함하는 약초들이 중요한 보완 전략으로 간주되었다. 따라서 본 연구는 이소퀴놀린 알칼로이드 성분을 포함한 백굴채 (Chelidonium majus L. var. asiaticum)를 이용하여 병용요법으로서의 가능성과 분자적 기전을 밝히고자 했다. 예로부터 식물에서 추출한 아이소퀴놀린 알칼로이드의 약리작용은 항염증, 진통, 향균 작용 등 잘 알려져 있다. 백굴채는 이러한 알칼로이드 성분을 많이 함유하고 있으며 최근 폐암, 위암, 유방암 등에서 항암효과가 보고된 바 있다. 백굴채추출물 처리는 시스플라틴에 민감한 세포주인 A2780세포와 시스플라틴 내성 세포주인 SKOV3세포를 포함한 난소 암 세포에서 농도 의존적으로 세포 생존력을 감소시켰고 세포사멸을 야기시켰다. 그러나 시스플라틴과 백굴채추출물 조합은 시너지 효과를 보이지 않았다. 백굴채추출물 처리는 두 세포에서 GADD45A 및 P21 발현의 상향 조절로 DNA 손상반응을 활성화 한 반면, CCNB1 발현은 A2780세포에서만 감소시켰다. 또한, siRNA를 통한 GADD45A 억제 실험결과, 백굴채추출물 처리시 증가되었던 P21, BRCA1, BAX의 발현패턴이 GADD45A 억제되었을 때는 사라짐을 보여 GADD45A가 백굴채추출물에 의해 유도된 세포 사멸에서 역할을 한다는 것을 확인했다. 백굴채추출물 처리효과의 기전을 이해하기 위해 백굴채추출물 처리에 대한 민감도에 따라 다섯가지의 난소암 세포를 두 그룹으로 나누어 microarray 데이터에 대한 GSEA 분석을 수행했다. 두 그룹에서 유의적으로 차이를 보이는 경로 중 하나가 MYC 표적이며 백굴채추출물 처리에 민감한 반응 세포에서 반응이 적은 세포보다 유의하게 높게 발현되었다. 상대적으로 덜 반응하는 세포주인 SKOV3에 MYC를 과발현시켰을 때, 백굴채추출물 처리시 BRCA1의 발현이 현저히 낮아졌고 이는 DNA 손상복구 시스템의 결핍을 나타낸다. 결론적으로 백굴채추출물 처리는 난소암 세포에서 GADD45A를 중심으로 한 DNA 손상반응을 활성화하여 세포사멸을 효과적으로 초래한다. 세포 내 MYC 발현이 높은 경우, 추출물 처리로 증가를 보이는 BRCA1의 발현을 저하시켜 손상복구를 저해함으로서 세포 독성효과에 대해 민감하게 작용하도록 돕는다. 본 연구결과에서 백굴채추출물 처리시 DNA 손상반응이 관여하는 것을 밝혔으나, 추출물 성분의 명확한 표적을 보이지 못한 제한점이 있다. 또한 세포모델에서 이루어진 실험으로 그 제한점을 가지고 있다. 그럼에도 불구하고 본 연구결과는 기존에 잘 알려지지 않은 백굴채추출물의 난소암의 항암 효과 기전을 밝히고, 이 효과의 민감도가 높은 세포의 서브타입을 제안한 의미가 있다.