Investigation of ocular irritancy of coal tar dyes using in vitro eye irritation tests and exploration of novel in vitro endpoints to identify ocular irritants

Abstract

It is essential to secure eye safety of ingredient of products that may be exposed to the eyes, such as cosmetics and daily products. Therefore, the evaluation of ocular irritation is mandated by regulation. Since in vivo Draize rabbit eye irritation test was developed in 1944, it has been predominantly used for eye irritation test (OECD TG 405). But, because this method imposes pain to rabbits, in vitro alternatives to Draize test are being actively established such as cytotoxicity-based methods, organotypic assays, and 3D reconstructed human cornea-like epithelium (RhCEs). Among in vitro eye irritation test methods, RhCEs are drawing attention for its similarity to real human cornea. In Korea, a new RhCE is developed by Biosolution Inc, which was approved as a me-too test method for OECD TG 492. Unfortunately, the eye irritation tests with RhCEs cannot fully address the gamut of ocular irritancy of chemicals compliant with UN GHS classification covering serious eye damage (Category 1), eye irritation (Categories 2A/2B), and non-classified (No Category). (Scott et al. 2010), and can lead to considerable mis-classification of nonirritating substances as moderate or weak eye irritant because of singe decision endpoint (tissue viability) to identify eye irritants (Jang, Jung et al. 2015, Yang, Kim et al. 2017). So, I conducted two studies to overcome these limitations. To solve these limitation, I combined several in vitro tests for classification eye irritancy of coal tar dyes used in cosmetics compliant with UN GHS classification and investigated eye irritation biomarker supplementing the classification made with viability of RhCE, using lipidomics and cytological approaches. First, To categorize eye irritancy of 15 coal tar dyes used in cosmetics according to UN GHS classification, I conducted in vitro tests with RhCE and the short time exposure (STE), in the framework of integrated bottom up approaches. So, 15 coal tar dyes can be classified in eye irritancy compliant with UN GHS classification. In detail, 10 coal tar dye were identified as non irritants (No cat) and Eosin YS, phloxine B, tetrachlorotetrabromofluorescein, and tetrabromofluorescein were identified as irritants in RhCEs; dibromofluorescein and uranine yielded discrepant results. STE enabled further classification in accordance with the UN Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, as follows: eosin YS as Cat 2; phloxine B, Cat 1; and tetrachlorotetrabromofluorescein and tetrabromofluorescein, Cat 1/2. STE indicated dibromofluorescein (irritant in EpiOcular™) and uranine (irritant in MCTT HCE™) as No Cat, resulting in the classification of “No prediction can be made.” based on bottom-up approach with each model. These results demonstrated that in vitro eye irritation tests can be utilized to evaluate the potential ocular irritancy of cosmetic ingredients and provide significant evidence with which to determine whether precautions should be given for the use of coal-tar dyes in cosmetics or other substances applied to the eye area. Second, To compensate for the limitation of using tissue viability as a single deciesion criterion in the RhCE eye irritation assay, I investgated biomarkers for eye irritation using lipidomics and cytological approaches. I explored lipid biomarkers for ocular irritants in RhCE, MCTT HCE™ . Three irritants; sodium lauryl sulfate, benzalkonium chloride and triton X-100 were selected to represent anionic, cationic and non-ionic detergent respectively. After treating MCTT HCE™ with irritants, the alteration of lipids in the treated tissues was examined with Nile Red staining, which revealed the depletion of corneal lipids. I further quantitated the release of ceramides and free fatty acids, major lipid components of cornea, into the medium during the post-treatment incubation, employing a sensitive UPLC-MS/MS method. Among 44 lipid species, nervonoylceramide (C24:1Cer) was found to be released commonly by all three irritants in a concentration-dependent manner. Tests with 10 additional reference substances further supported that C24:1Cer release was significantly correlated with viability. Examination of the genes involved in the biosynthetic pathway for C24:1Cer revealed that stearoylCoA desaturase (SCD) and elongase1 (ELOVL1) were upregulated, suggesting that lipids and related genes may be employed as biomarkers for ocular irritants. Finally, to supplement the classification made with viability of RhCE, cytological assessment was conducted to evaluate changes of morphology of cells isolated form chemical-treated MCTT HCETM. 20 reference chemicals (8 non irritants, 12 irritants) were selected to represent irritants, non-irritants and borderline values. Through cell viability assay, WST-1 assay, 2 chemicals indicated false positives, 3 chemicals indicated false negatives and 2 chemicals appears as a borderline irritant. Whereas, when cytological changes was quantified with Image J software, out of 7 chemicals misclassified or on borderline with WST-1 assay, 5 chemicals were correctly classified and only 2 chemicals remains in false classification. Additionally, I evaluated cytology of cells isolated from WST-1-treated MCTT HCETM to examine possibility of utilization of MCTT HCETM remaining after WST-1 assay. Unfortunately, 8 (non-irritant; EM and irritant; DB, DBB, SO, SB, DH, TMSO, and HCA) of 20 reference chemicals were miscategorized according to density of cells quantified with Image J. These results suggest although cytology can complement the classification of eye irritancy in the eye irritation test using RhCE, additional research is needed to utilize RhCE after cell viability measurement. In conclusion, This study proved classification of eye irritancy according to UN GHS can be achieved by combining two or more in vitro eye irritation tests in the framework of integrated approaches, and the new lipid biomarker (C24:1Cer) and cytological evaluation can be used as a new end point that complements solo decision criteria of viability in RhCE. ;화장품, 생활용품 등 눈에 노출 될 수 있는 제품 성분이 안자극을 일으키지 않고 안전한가를 확인하는 것은 꼭 필요하다. 따라서 안자극의 평가는 의무적으로 규정에 맞게 시행되야 한다. Draize 토끼 안자극 시험법은 1944년에 개발된 이래 주된 안자극 시험으로 사용되었다 (OECD TG 405). 그러나 이 방법은 토끼에게 통증을 유발하기 때문에 세포 독성 기반 방법, 분리된 기관을 사용한 방법, 재구성된 인체 각막모델을 (RhCE) 사용하는 방법과 같은 in vitro 동물대체시험법들이 활발하게 개발되고있다. 최근 In vitro 동물대체시험법들 중 RhCE가 주목 받고 있다. 국내에서는 바이오 솔루션에서 사람 각막 상피세포를 3D 배양하여 상피조직 모델 (MCTT HCETM)을 새로 제작했다 (OECD TG 492). 하지만 안타깝게도 RhCE을 사용하는 안자극 시험법은 비자극 물질만 분류 할 수 있어 UN GHS 분류의 모든 범위의 안자극 정도를 평가 할 수 없다. 또한 안자극을 분류하기 위한 종말점으로 세포 생존율만 사용하고 있어 종종 약자극물질을 비자극으로 잘못 판단한다. 그래서 나는 이러한 RhCE의 한계점를 극복하기 위한 두가지 노력을 했다. 첫째, in vitro 안자극 시험법인 RhCE 시험법과 (MCTT HCETM, EpiOcularTM)와 단시간 노출 시험법을 (STE) 조합하는 상향식 접근법으로 화장품에 상용되는 콜타르 염료 15종의 안자극 가능성을 평가했다. 이러한 방법으로 15개의 콜타르 염료를 UN GHS 분류 (강자극 : Cat 1, 약자극 : Cat 2A/2B, 비자극 : No cat) 에 맞게 평가 할 수 있다. 먼저 두가지 RhCE 시험법으로 (MCTT HCETM, EpiOcularTM) 비자극 (No cat)을 분리하고, 그 외 물질을 STE로 다시한번 안자극을 평가하여 강자극 (Cat 1)과 약자극 (Cat 2)를 분리하였다. 그 결과, 먼저 RhCE 시험을 통해 8개종을 비자극 물질로 분류 할 수 있었고 Eosin YS, phloxine B, tetrachlorotetrabromo fluorescein 그리고 tetrabromo-fluorescein은 두가지 RhCE 모델에서 자극물질로 확인됐다. dibromofluorescein과 uranine은 두가지 RhCE 시험법에서 일치하지 않는 결과가 나왔다. 그리고 RhCE시험법에서 자극 물질로 분류된 염료를 STE 시행한 결과 eosin YS 은 Cat 2, phloxine B은 Cat 1, tetrachlorotetrabromofluorescein과 tetrabromo-fluorescein은 Cat 1/2로 분류됐다. 또한 STE는 dibromofluorescein (EpiOcular™에서 안자극) 과 uranine (MCTT HCE™에서 안자극)을 No Cat으로 평가했으므로 최종적으로 예측하지 못하거나 Cat 2 로 평가될 수 있다. 이러한 결과를 통해 in vitro 안자극 시험법은 화장품 성분의 잠재적인 안자극 가능성을 평가할 수 있으며 콜타르 염료를 사용할 때 예방 조치가 필요한지 여부를 결정하는데 in vitro 안자극 시험법이 중요한 근거가 될 수 있음을 밝혔다. 둘째, RhCE 안자극 시험법에서 조직 생존율을 단일 안자극 평가 기준으로 사용할 때 생기는 한계점을 보완하기 위해 안자극 바이오 마커를 지질학적 접근법을 통해 찾았고 세포학적 평가를 통해 조직 생존율의 결과를 보완했다. 먼저, MCTT HCE™ 에서 안자극에 대한 지질 바이오 마커를 조사했다. 음이온 성, 양이온 성 및 비이온성 detergent를 대표하는 세 가지 자극물질을 선정했다 (sodium lauryl sulfate, benzalkonium chloride, triton X-100). MCTT HCE ™에 자극물질을 처리 한 후, 처리된 조직의 지질 변화를 Nile Red로 염색하여 각막에서 지질이 줄어드는 것을 확인했다. 자극물질 처리 후 후배양 할 때, 각막의 주요 지질 성분인 세라마이드와 유리 지방산이 배지로 방출하는 것을 UPLC-MS/MS 방법을 통해서 정량 했다. 44종의 지질 중 nervonoylceramide (C24:1Cer)가 세 가지 자극제 모두에 의해 농도 의존적으로 배지로 방출된 것으로 밝혀졌다. 그래서 참고 물질을 10개를 추가로 확인한 결과 C24:1Cer 방출이 세포 생존율과 유의한 상관관계가 있음을 알 수 있었다. 또한, C24:1Cer의 생합성 경로에 관여하는 유전자를 조사한 결과 stearoylCoA desaturase(SCD) 와 elongase1 (ELOVL1)의 발현이 증가하였다. 이는 지질 및 지질 관련 유전자가 안자극 바이오 마커로 사용될 수 있음을 시사한다. 마지막으로, 시험물질에 의한 MCTT HCETM의 세포학적 변화와 조직 생존율 결과를 비교했다. 시험물질 처리된 MCTT HCETM에서 분리한 세포의 형태 변화를 평가하기 위해 giemsa 염색을 한 후 세포의 변화를 시각적 평가와 Image J를 활용한 정량적 방법을 통해 확인하였다. 먼저 시험물질로 자극 물질, 비작극 물질, 그리고 RhCE 시험법에서 경계값으로 평가되는 물질을 포함하는 것으로 20개의 참고물질을 선택했다 (UB GHS 분류에 따른 비자극 물질 8개, 자극 물질 12개). WST-1 분석을 통해 조직 생존율을 평가한 결과 2개 물질은 위양성을, 3개 물질은 위음성, 2개 물질은 경계선상에 있지만 자극 물질로 평가됐다. 반면 Image J 소프트웨어로 정량 하여 세포학적 변화를 평가했 때, 조직 생존율로는 잘못 분류되거나 경계선에 있었던 7가지 시험물질 중 5가지 시험물질이 올바르게 분류되었으며 2가지 시험물질만 잘못 분류되었다. 또한 WST-1 분석 후 남은 MCTT HCETM의 활용 가능성을 조사하기 위해 WST-1 처리된 MCTT HCETM에서 분리한 세포를 세포학적 평가를 했다. Image J 로 정량화 했을 때, 불행히도 20개의 참고 물질 중 8개 (비자극 물질 : EM 및 자극 물질 : DB, DBB, SO, SB, DH, TMSO, HCA)가 잘못 분류되었다. 이러한 결과는 세포학 검사는 RhCE를 시험법에서 조직 생존율에 의한 안자극을 분류를 보완 할 수는 있지만 세포 생존율 측정 후의 RhCE를 활용하기 위해서는 추가적인 연구가 필요함을 시사한다. 결론적으로, 본 연구를 통해 RhCE와 STE 시험법을 조합하여 UN GHS 분류에 맞는 새로운 안자극 분류 정보를 제공하였고, 새로운 지질 바이오 마커 (C24:1Cer) 와 세포학적 평가는 RhCE 안자극 시험법의 조직 생존율을 이용한 결과를 보완해주는 새로운 종말점으로 사용가능 하다는 것을 입증하였다.