Development of molecular diagnostic platforms for the detection of genetic mutations and small-molecule based on dumbbell-shaped DNA probes

Abstract

The recent outbreak of COVID-19 pandemic has drawn much attention in in vitro molecular diagnostics. In this thesis paper, I liked to introduce molecular diagnostics platforms based on dumbbell-shaped DNA probes. The study was divided in two chapters, depending on the types of target materials. The first chapter, I aimed to detect point mutant genes in single and double-stranded DNA, specifically, epidermal growth factor receptor (EGFR)21 point mutations. The second chapter focused on the detection of a small-molecule target such as ATP as a model small molecule. A genetic mutation such as single nucleotide polymorphism (SNP) is used as a biomarker for early cancer detection. As the necessity for the accurate diagnosis of genetic mutations increases, we aimed to design a dumbbell-shaped DNA probe to precisely distinguish point mutations with only one nucleotide difference. The dumbbell-shaped DNA probe was consisted of two separate strands of DNA, which had a complementary binding sequence to the target gene at the distal ends. To further enhance the sequence specificity, we added a gap-filling approach that selectively filled out the emptied position at the point mutation site. Therefore, the dumbbell probes can only be amplified when the matched base sequence was hybridized. When the target genes was present, a fully closed circular DNA probe could be formed through strand-ligation, and the template DNA probe could be further amplified through rolling circle amplfication (RCA), which is isothermal amplification technology. Through this simple and robust diagnostic method, the developed diagnostic platform clearly shows promising potential in the diagnosis of genetic mutations. Recently, Korean society has encountered increased drug-related crimes, leading increased demand of the point-of-care testing for narcotic drugs. Previously, oligonucleotide based aptamers were often used to detect small-molecule targets. In particular, it was called as an aptasensor when structural changes were observed after the binding to the target molecules. In this study, I applied dumbbell-shaped DNA probes for small-molecule diagnostics. One distal ends of the probe was designed to have a complementary binding sequence with ATP aptamer, and the other ends was designed with repeated units of cytosine(C) to form a G-quadruplex structure after isothermal amplification. Prior to applying the dumbbell probes to detect narcotic drug molecules, I used ATP as a model molecule for aptasensor to confirm the feasibility of diagnostic systems. As a turn-off system, the fluorescence intensity was decreased when target ATP was present. In the case of ATP aptamer, the difference of ratio between the positive signal to background signal was not clear. I could overcome this shortcoming by obtaining amplified signals with dumbbell-shaped DNA probes. Based on the possibilities shown in this study, I hope to broaden the applications of dumbbell-shaped DNA probes to other small-molecules diagnostics.;최근의 전세계적인 코로나19 확산으로 인해 분자진단에 대한 관심이 더욱 증가하였습니다. 본 연구에서는 덤벨 모양의 DNA probe를 기반으로 한 분자진단 시스템에 대해 소개하고자 합니다. 본 연구는 타겟 물질의 종류에 따라 크게 두 가지로 나눠서 진행해 보았습니다. 첫째는 단일가닥과 이중가닥 DNA에서의 점 돌연변이 유전자를 타겟으로 하였고, 구체적으로 표피인자성장수용체(EGFR)21 점 돌연변이에 관한 연구를 진행하였습니다. 두 번째는 small-molecule을 타겟으로 한 연구로, ATP를 우선적으로 타겟 물질로하여 시행해보았습니다. 유전자 돌연변이는 암의 바이오마커로 사용되기도 하며 초기 암 진단에 주요한 인자로 작용하고 있습니다. 또한, 특정 약물의 사용을 위해서도 정확한 유전자 돌연변이 검사가 반드시 요구되기도 합니다. 이처럼 유전자 돌연변이에 대한 정확한 진단의 필요가 증대됨에 따라 본 연구진은 하나의 뉴클레오타이드의 차이만 있는 점 돌연변이를 정확히 구분해내기 위한 덤벨 모양 DNA probe를 설계하였습니다. 덤벨 모양 DNA probe는 두 가닥의 DNA로 이루어져 있으며, 한 쪽 말단이 타겟 유전자와 결합할 수 있는 상보적인 서열로 구성되어 있습니다. 진단의 정확도를 더 높이기 위해 돌연변이 위치의 염기를 비운 갭 필링 시스템을 도입하여 정확히 매칭이 되는 염기서열에서만 증폭할 수 있도록 특이도를 높였습니다. Probe가 타겟 서열과 결합하게 되면 결찰을 통해 완전히 닫힌 덤벨 구조의 probe가 형성되고, RCA의 등온증폭기술을 통해 증폭산물을 만들게 됩니다. 이처럼 간단하면서 정확한 진단기술을 통해 유전자 돌연변이에 대한 감별을 정확하게 할 수 있는 유망한 가능성을 확인하였습니다. 사회적으로 마약과 관련한 범죄가 증가하면서 마약의 현장진단에 대한 요구가 증가했습니다. 기존에는 마약류나 소분자를 진단하기 위해서 aptamer를 이용하였습니다. 특히, 단순히 타겟 물질과 aptamer 사이의 결합뿐만 아니라 결합 후의 구조변화를 이용해 센서로의 역할을 할 수 있도록 한 것을 aptasensor라고 합니다. 본 연구에서는 덤벨 모양 DNA probe를 small-molecule 진단에 사용해보고자 제안합니다. 덤벨 구조의 한 쪽 말단은 ATP aptamer와 결합할 수 있는 상보적인 서열로 되어있고, 다른 쪽 말단은 증폭한 후 G-quadruplex 구조를 형성할 수 있도록 사이토신(C)의 반복 단위를 넣어 설계하였습니다. 덤벨 probe를 small-molecule 진단에 적용하기에 앞서 기존의 aptasensor의 타겟 물질로 널리 연구되어진 ATP 검출을 통해 aptasensor가 실제로 작동하는지 먼저 확인해보고, 덤벨 모양의 DNA probe를 적용한 시스템과 그 효율을 비교해보았습니다. ATP aptamer가 방출하는 형광값의 세기는 ATP가 존재하게 되면 방출되는 형광값의 세기가 줄어듭니다. 기존의 ATP aptamer의 경우, aptamer 자체의 형광값과 ATP가 존재할 때의 형광값의 차이가 크지 않다는 단점이 존재하였습니다. 덤벨 모양의 DNA probe를 사용하면 증폭된 신호를 얻어 ATP 존재유무에 대한 신호값 차이를 명확히 하여 이러한 단점을 극복할 수 있습니다. 본 연구결과에서 보여진 가능성을 바탕으로 ATP뿐만 아니라 다른 소분자의 검출시에서까지도 그 적용범위를 넓혀가기를 기대합니다.