GTSE1 is involved in the radiation-induced EMT process via ZEB1

Abstract

방사선 유도성 폐섬유화 (RIPF)는 방사선 치료를 받은 폐암 환자에게서 발생할 수 있는 주요 부작용이다. 앞 선 연구에서, GTSE1은 고선량의 방사선을 조사했을 때 부작용으로 일어날 수 있는 방사선 유도성 폐섬유화와 관련된 유전자로 규명되었다. EMT는 많은 전사 인자, 신호 분자 및 단백질을 포함하는 섬유증 및 상처 치유에서 매우 중요한 생리적 과정으로 알려져 있다. 본 연구에서 정상 폐 상피세포주 중에 하나인 L132 세포를 사용하여 GTSE1이 상피-간엽 이행 (EMT)의 발달에 관련되어있음을 보였다. L132 세포에 shgtse1을 형질주입 (transfection) 시켰을 때 상피세포의 표지인 E-cadherin은 증가하고, 중간엽세포의 표지들은 감소하였다. 또한 GTSE1이 하향조절 됐을 때, E-cadherin과 TWIST, Snail, ZEB1, STAT3과 같은 EMT 표지를 비교해서 GTSE1이 ZEB1의 상위에 있음을 알아냈다. 또한 GTSE1에 의한 ZEB1의 조절이 유전자가 아닌 단백질 수준에서 이루어지는 것을 확인하고, 면역침강반응 (immunoprecipitation)을 이용해 GTSE1이 직접적인 결합을 통해서 ZEB1을 조절함을 알 수 있었다. 더해서 유비퀴틴 (ubiquitin)과의 상호작용을 확인해서 ZEB1의 조절이 단백질 분해효소 경로 (proteasome pathway)에 의해 일어난다는 것을 밝혔다. 최근의 연구에 따르면 GTSE1과 ZEB1은 각각 세포질과 핵에 주로 위치한다. GTSE1과 ZEB1의 주요 위치가 다르다는 것을 고려하여 GTSE1에 의한 ZEB1의 조절이 어디서 일어나는지 알아내기 위해 초원심세포분획법 (subcellular fractionation)을 진행했다. 초원심세포분획법을 통해 확인한 결과, 방사선에 의해서 GTSE1이 핵 내에서 증가하는 경향을 보였으나 세포질과 핵 내에 비슷하게 분포하는 것을 확인할 수 있었다. ZEB1은 주로 핵 내에 위치하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과를 통해 GTSE1과 ZEB1의 상호작용은 핵 내에서 일어남을 알 수 있다. EMT에서 ZEB1은 중요한 전사인자이며 일반적으로 낮은 농도로 유지된다. 이 조절은 ZEB1의 E3 유비퀴틴 리가아제 (E3 ubiquitin ligase)로 알려진 Siah1/2 및 Fbxo45에 의한 지속적인 분해 때문일 것이라 예상된다. 이 예상에 따르면 GTSE1은 Siah1/2 또는 Fbxo45에 의한 ZEB1의 폴리유비퀴틴화 (polyubiquitination)를 억제하여 ZEB1의 안정화를 유도할 수 있으며, 이 때 GTSE1은 E3 유비퀴틴 리가아제의 억제제로 작용한다. IR에 의한 DNA 손상이 일어나면 인산화된 ATM은 ZEB1을 인산화하여 ZEB1의 안정화를 증가시킨다. siRNA를 사용하여 GTSE1이 결핍되었을 때, DNA 손상 복구에 관여하는 단백질의 인산화가 감소한다는 연구 결과가 있었다. 그러나 GTSE1과 ZEB1의 상호작용을 면역침강반응을 통해 확인하였기 때문에 GTSE1이 ZEB1의 인산화에 관여할 것이라고 예상된다. 이를 확인하기 위해서는 활성화된 ATM에 의해 인산화되는 ZEB1의 S585 잔기의 돌연변이 연구가 필요하다. 결론적으로, 이 연구는 GTSE1이 폐섬유증의 효과적인 치료 표적이 될 수 있음을 시사한다. 따라서 GTSE1과 ZEB1 사이의 상호 작용을 조절하는 신호 전달 및 유비퀴틴화 경로에 대한 보다 자세한 연구가 필요하다. 또한 GTSE1과 ZEB1 상호작용 경로와 ZEB1의 조절에 관여하는 번역 후 수정 (posttranslation modification)에 대한 면밀한 연구가 필요하다.;Radiation-induced pulmonary fibrosis (RIPF) is one of the major side effects on patients after lung cancer radiation therapy. To establish an effective treatment strategy for RIPF, mechanism researches on lung fibrosis is needed. Thus, we have investigated the regulatory response genes and proteins for RIPF. In previous studies, when the lungs of C57BL6 mice were irradiated with high focal ionizing radiation (IR) of 90 Gy, upregulation of G2 and S phase-expressed protein 1 (GTSE1) was observed in the irradiated lung. Inhibition of radiation-induced epithelial-mesenchymal transition (EMT) and cell migration preconditioned by knockdown of GTSE1 were observed, suggesting that GTSE1 is involved in radiation-induced EMT process and fibrosis. In normal lung epithelial L132 cells, short hairpin RNA (shRNA) was used to create GTSE1-deficient L132 cells. When irradiated with IR (8 Gy) in GTSE1-deficient L132 cells, an increase in E-cadherin expression and a decrease in ZEB1 expression were also observed. On the other hand, other EMT-related transcription factors such as TWIST, Snail, and STAT3 were not significantly changed. Moreover, the interaction between GTSE1 and ZEB1 and the increased ubiquitination of ZEB1 was found in L132 GTSE1-deficient cells, suggesting that GTSE1 may be involved in the ZEB1 ubiquitination pathway. Therefore, revealing the regulatory mechanisms of ZEB1 ubiquitination by GTSE1 might provide clues for drug development of RIPF.