Full metadata record
DC Field | Value | Language |
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dc.contributor.advisor | 이혁진 | - |
dc.contributor.author | 장혜진 | - |
dc.creator | 장혜진 | - |
dc.date.accessioned | 2021-01-25T16:30:06Z | - |
dc.date.available | 2021-01-25T16:30:06Z | - |
dc.date.issued | 2021 | - |
dc.identifier.other | OAK-000000172722 | - |
dc.identifier.uri | http://dcollection.ewha.ac.kr/common/orgView/000000172722 | en_US |
dc.identifier.uri | https://dspace.ewha.ac.kr/handle/2015.oak/256024 | - |
dc.description.abstract | RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional mechanism that reduces gene expression in a sequence-specific manner. RNAi-based therapeutics are in the spotlight in the drug development market and two siRNA therapeutics have been recently approved by the US FDA. Dicer substrate siRNAs (DsiRNA) are duplex RNAs of 25-30nt with 2nt overhang at the 5’ end of antisense strand. In cells, Dicer cleavage generates short dsRNA from DsiRNA and facilitates Argonaute 2 (Ago2) loading to form an active RNA-induced silencing complex (RISC). In the previous study, three-arm junction RNA nanostructures (Y-RNAs) have been developed that can be utilized act as Dicer substrates. They showed more potent gene silencing activity than canonical siRNAs. The mechanism of enhanced potency of Y-RNA was not yet clear. A double-stranded substrate RNA is properly inserted into the Dicer by TRBP formed a complex with Dicer. Then, RISC, formed by Ago2 loading of the cleaved product, silences the target gene. Therefore, the formation of RISC, an effector of RNAi, is a key step in gene silencing mechanism. Herein, the enhanced potency of Y-RNAs was demonstrated by the evaluation of binding and cleavage of them during RNAi mechanisms using fluorescence polarization (FP) assay. We found that canonical siRNAs and Dicer substrate RNAs were significantly different in the binding with RISC-associated proteins. Dicer substrate RNAs had 37 times stronger binding affinity than canonical siRNAs, especially in the binding with TRBP. High affinity binding with TRBP allowed Dicer substrate RNAs to be loaded into RISC at even lower concentration conditions than the canonical siRNAs. In the FP-based competitive binding assay, Y-RNAs also showed similar binding patterns to DsiRNAs. This phenomenon clearly elucidated the enhanced potency of Y-RNAs. In addition, there were still some barriers to use Y-RNA as therapeutics. Native Y-RNAs required improved in vivo stability to deliver by themselves in a way other than LNPs. In addition, native Y-RNAs induced stronger innate immune responses than canonical siRNAs. These limitations could be resolved using chemical modification on Y-RNAs. However, the indiscriminate application of conventional chemical modification approaches, mainly used in siRNAs, to Y-RNAs can negatively affect their efficacy. Therefore, we developed a position specific chemical modification and its effect on the activity of RNA nanostructures was evaluated. We demonstrated that Dicer substrate RNA nanostructures modified with our approach showed strong resistance to endonuclease in serum and reduced cytokine induction. The efficacy of modified Y-RNA was verified in vivo for two different target genes, FVII and mouse TTR. Compared to canonical siRNA, IC50 value of chem. modified Y-RNA was about 2 to 4 times lower. The effects of chemical modification were more substantial in in vivo due to the improved serum stability and less immunogenic property. These data suggested that our position specific modification approach could be widely applicable to various Dicer substrate RNA nanostructures without compromising their potency.;RNA interference (RNAi)는 서열 특이적으로 유전자 발현을 감소시키는 세포내 과정이다. RNAi 기반 치료제는 시장에서 각광을 받고 있으며 최근 미국 FDA에서 2개의 siRNA 치료제가 승인되었다. 다이서 기질 siRNA (DsiRNA)는 안티센스의 5' 말단에 2nt 오버행을 지닌 25-30bp의 이중 가닥 RNA이다. 세포에서 다이서 절단은 DsiRNA로부터 짧은 dsRNA를 만들고, Ago2로딩을 촉진하여 활성화된 RNA 유도 침묵 복합체 (RISC)를 형성한다. 이전 연구에서 우리는 3개의 팔이 연결된 RNA 나노 구조체 (Y-RNA)를 개발했다. Y-RNA은 기존 siRNA보다 더 강력한 유전자 침묵 활성을 보였다. Y-RNA에서 증가된 효능의 메커니즘은 아직 명확하지 않다. 게다가 아직 Y-RNA를 치료제로 사용하는 데는 여전히 몇 가지 장벽이 있다. LNP가 아닌, Y-RNA 본연의 상태로 체내에 전달하려면 체내 안정성을 향상시킬 필요가 있다. 게다가 Y-RNA는 기존의 siRNA보다 가닥의 길이가 훨씬 길어 강력한 선천성 면역 반응을 유도한다. 이러한 한계점은 Y-RNA에 화학적 변형을 적용하여 RNA 생체내 특성을 개선하여 해결할 수 있다. 외인성 이중 가닥 RNA는 다이서와 결합된 TRBP에 의해 Dicer로 적절하게 끼어들어가게 된다. 다이서에 의해 만들어진 생성물은 Ago2에 로딩되고 passenger 가닥이 잘려 나가면 활성화된 RISC를 형성한다. 그러므로, RNAi의 effector 역할을 하는 RISC의 형성은 RNAi 과정에서 핵심 단계이다. 여기에서, 우리는 형광 편광을 이용하여 다이서 기질 RNA의 강화된 효능을 메커니즘 측면에서 설명하려 했다. 우리는 기존의 siRNA와 다이서 기질 RNA간에 RISC 관련 단백질과의 결합에서 크게 차이가 나는 것을 발견했다. 특히, TRBP와의 결합은 다이서 기질 RNA가 기존 siRNA 보다 37배 더 우수했다. TRBP와의 고친화성 결합은 다이서 기질 RNA가 기존의 siRNA보다 훨씬 낮은 농도조건에서도 RISC에 로딩될 수 있게 해준다. 이는 다이서 기질 RNA의 높은 효능을 명확하게 설명한다. 마지막으로, 위치 특이적 화학 변형을 개발하고 RNA 나노 구조체의 활성에 미치는 영향을 평가했다. 우리의 패턴으로 화학적 변형이 적용된 다이서 기질 RNA 나노구조체는 혈청 내 엔도뉴클레이즈에 대해 저항성을 지니며 사이토카인 유도가 감소됨을 확인하였다. 변형된 Y-RNA의 효능은 두 가지 서로 다른 표적 유전자, Factor VII 및 마우스 TTR에 대해 생체내에서 검증되었다. 화학적 변형이 적용된 Y-RNA에서 IC50 값은 기존 siRNA와 비교하여 2-4배 정도 낮았다. 화학적 변형에 의한 효과는 향상된 혈청 안정성과 감소된 면역원성으로 인하여 생체 내에서 더 명확하게 관찰되었다. 이러한 데이터는 우리의 위치 특이적 화학적 변형 방법이 효능을 감소시키지 않으면서 다이서 기질 RNA 나노 구조체에 범용적으로 적용 가능함을 시사한다. | - |
dc.description.tableofcontents | I. Introduction 1 II. Materials and Methods 6 A. Materials 6 B. Determination of binding affinity by Fluorescence polarization 7 C. In vitro Dicer processing assay 8 D. In vitro serum stability 9 E. Human PBMC assays 9 F. Formulation of lipid nanoparticles 10 G. Lipid nanoparticle characterization 10 1. Dynamic light scattering 10 2. Ribogreen assay 11 H. In vivo animal study 11 III. Results and discussion 13 A. Characterization of the interaction of siRNAs and DsiRNAs to RLC components by direct FP assay 13 B. Characterization of the interaction of Y-RNA to RLC components by FPbased competition assay 15 C. Confirmation of the influence of TRBP on kinetics of Dicer processing through Dicer cleavage assay 17 D. Comparison of the interaction of DsiRNA with RLC components according to the modification approach 19 E. Determination of the effects of chemical modification on the serum stability of substrate RNAs 21 F. Investigation of immunogenicity of chemically modified DsiRNAs and Y-RNAs by human PBMC assay 23 G. In vivo evaluation of gene silencing activity of chemically modified DsiRNAs targeting Factor VII gene 25 H. In vivo evaluation of gene silencing activity against Factor VII target genes of chemically modified Y-RNAs 27 I. Determination of inhibitory potency (IC50) of chemically modified substrate RNAs targeting Factor VII gene 29 J. In vivo evaluation of gene silencing activity against mTTR target genes of chemically modified Dicer substrate RNAs 31 K. In vivo evaluation of gene silencing activity of chemically modified YRNAs targeting mTTR gene 33 L. Determination of inhibitory potency(IC50) of chemically modified substrate RNAs targeting mouse TTR gene 35 IV. Conclusion 37 Reference 38 Appendix 40 Abstract (in Korean) 44 | - |
dc.format | application/pdf | - |
dc.format.extent | 3107601 bytes | - |
dc.language | eng | - |
dc.publisher | 이화여자대학교 대학원 | - |
dc.subject.ddc | 600 | - |
dc.title | Systematic evaluation and optimization of chemically modified Dicer substrate RNA nanostructures | - |
dc.type | Master's Thesis | - |
dc.format.page | vii, 45 p. | - |
dc.identifier.thesisdegree | Master | - |
dc.identifier.major | 대학원 약학과 | - |
dc.date.awarded | 2021. 2 | - |